Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Summary

Lipidmonoschichten werden seit Jahrzehnten als Grundlage für die Bildung von zweidimensionalen (2D) Proteinkristallen für Strukturstudien verwendet. Sie sind an der Luft-Wasser-Grenzfläche stabil und können als dünnes Trägermaterial für die Elektronenbildgebung dienen. Hier stellen wir die bewährten Schritte zur Herstellung von Lipidmonolayern für biologische Studien vor.

Abstract

Die Elektronenkristallographie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur hochauflösenden Strukturbestimmung. Makromoleküle wie lösliche oder Membranproteine können unter günstigen Bedingungen zu hochgeordneten zweidimensionalen (2D) Kristallen gezüchtet werden. Die Qualität der gezüchteten 2D-Kristalle ist entscheidend für die Auflösung der finalen Rekonstruktion mittels 2D-Bildverarbeitung. Im Laufe der Jahre wurden Lipidmonoschichten als unterstützende Schicht verwendet, um die 2D-Kristallisation von peripheren Membranproteinen sowie löslichen Proteinen zu fördern. Diese Methode kann auch auf die 2D-Kristallisation integraler Membranproteine angewendet werden, erfordert jedoch umfangreichere empirische Untersuchungen, um Waschmittel- und Dialysebedingungen zu bestimmen, um die Aufteilung auf die Monoschicht zu fördern. An der Luft-Wasser-Grenzfläche bildet sich eine Lipidmonoschicht, so dass die polaren Lipidkopfgruppen in der wässrigen Phase hydratisiert bleiben und die unpolaren Acylketten, Schwänze sich in die Luft aufteilen, die Oberflächenspannung brechen und die Wasseroberfläche abflachen. Die geladene Natur oder die charakteristischen chemischen Bestandteile der Kopfgruppen bieten eine Affinität für Proteine in Lösung und fördern die Bindung für die Bildung von 2D-Arrays. Eine neu gebildete Monoschicht mit dem 2D-Array kann leicht in ein Elektronenmikroskop (EM) auf einem kohlenstoffbeschichteten Kupfergitter übertragen werden, das zum Heben und Unterstützen des kristallinen Arrays verwendet wird. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Lipid-Monolayer-Methodik für die kryogene elektronenmikroskopische (Kryo-EM) Bildgebung.

Introduction

Elektronenbeugung durch 2D-Kristalle oder spiralförmige Arrays von Proteinen können in günstigen Fällen Sub-Nanometer-Auflösungen erreichen^1,2,3. Von besonderem Interesse sind rekonstituierte 2D-Membranproteinarrays oder Kristalle in ihren nahezu nativen Umgebungen¹. Da ein Kristall als Signalverstärker fungiert, der die Dichte der strukturellen Faktoren bei bestimmten räumlichen Frequenzen erhöht, ermöglicht die Elektronenkristallographie die Sondierung eines Ziels mit einer kleineren Größe bei hohen Auflösungen, z. B. kleinen Molekülen, als bei Einzelpartikel-Kryo-EM. Der Elektronenstrahl kann durch ein geordnetes 2D-Array von Proteinen gebeugt werden, wodurch ein Beugungsmuster oder ein Gitterbild erzeugt wird, je nachdem, wo die Bildebene auf dem^{Detektor aufgezeichnet}wird 4 . Die gebeugten Intensitäten können dann extrahiert und verarbeitet werden, um eine 2D-Projektionsstruktur des Kristalls zu rekonstruieren. Elektronen haben einen größeren Streuquerschnitt als Röntgenstrahlen und ihre Streuung folgt größtenteils dem Rutherford-Modell, das auf der Coulomb-Wechselwirkung zwischen den Elektronen und den geladenen Atomen im^{Molekül basiert 5}. Die Dicken von 2D-Membrankristallen betragen in der Regel weniger als 100 nm, geeignet für die Elektronenübertragung ohne dynamische Streuung innerhalb der Probe⁶. Elektronenkristallographische Studien haben sich als leistungsfähiges Werkzeug erwiesen, um hochauflösende Strukturinformationen von Membranproteinen und Lipid-Protein-Interaktionen zu untersuchen^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}.

Eine Lipidmonoschicht ist eine einzelne Lipidschicht, die aus Phospholipiden besteht, die dicht an einer Luft-Wasser-Grenzfläche⁶gepackt sind und die 2D-Array-Bildung für lösliche Proteine oder periphere Membranproteine unterstützen können¹⁸. Abhängig von der Dichte der Lipide und ihrem lateralen Druck können die Lipidmoleküle ein geordnetes 2D-Array an der Luft-Wasser-Grenzfläche bilden, wobei ihre acylketten auf die Luft ausgedehnt sind und hydrophile Kopfgruppen in der wässrigen Lösung^1,6,19freigelegt werden . Die Lipidkopfgruppe kann über elektrostatische Interaktion mit Proteinen interagieren oder modifiziert werden, um ein Affinitäts-Tag bereitzustellen, um eine bestimmte Proteindomäne zu binden. Zum Beispiel wird das DOGS-NTA-Ni (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]^2-Ni2+ ) häufig bei der Bildung einer Lipidmonoschicht verwendet, um die Proteine mit einem Poly-Histidin-Tag^20,21,22zu binden . Auch das Choleratoxin B kann ein bestimmtes Pentasaccharid von Gangliosid GM1 in einer Lipidmonoschicht für Strukturstudien^{binden 23,24}. Durch die Verankerung der Proteine auf den Lipidkopfgruppen kann die Lipidmonoschicht die Bildung der dünnen 2D-Arrays für hochauflösende elektronenkristallographische Studien unterstützen. Die Lipid-Monolayer-Technik wurde in der Elektronenkristallographie für Strukturstudien von Proteinen wie Streptavidin^2,25, Annexin V²⁶, Choleratoxin²⁷, E. coli gyrase B Untereinheit²⁸, E. coli RNA Polymerase²⁵,^29,30, Carboxysomenschalenproteine³¹ und die Kapsidproteine des HIV-1³² und Moloney murinen Leukämievirus ^{verwendet 33}. Aufgrund der Stabilität und chemischen Eigenschaften der Lipidmonoschicht wurden verschiedene Anwendungen für die Probenvorbereitung für die Kryo-EM-Bildgebung untersucht³⁴. Für die Bildung von Protein-Arrays ist jedoch eine Optimierung erforderlich.

Hier geben wir ausführliche Details zur allgemeinen Herstellung von Lipidmonoschichten für die Kryo-EM-Bildgebung und einige Überlegungen, die die Qualität der gebildeten Monoschichten beeinflussen könnten.

Protocol

1. Teflonblock-Zubereitung Bereiten Sie den Teflonblock aus chemikalienbeständigem PTFE-Harz (Polytetrafluorethylen) vor. Machen Sie Löcher auf dem Block mit einem allgemeinen Bohrer, gefolgt von den in Abbildung 1beschrifteten Abmessungen. 2. Monolayer-Lipidpräparation HINWEIS: Geschätzte Betriebszeit: 30- 45 Minuten Lipid-Stoffaufbereitung Ein 0,01 mg/ml Lipidgemi…

Representative Results

Eine auf dem EM-Gitter abgeschiedene Lipidmonoschicht kann unter einem Transmissionselektronenmikroskop (TEM) ohne Färbung visualisiert werden. Die Monoschichtpräsenz ist an der Kontrastdifferenz zur Fläche ohne Probe im Strahlengang zu erkennen. Bereiche mit Lipid-Monolayer-Abdeckung haben einen geringeren lokalen Kontrast als solche ohne Abdeckung, da der Elektronenstrahl durch die leeren Löcher keine Streuung aufweist und eine hellere Beleuchtung zeigt (Abbildung 3). <p class="jov…

Discussion

Eine Lipidmonoschicht ist ein leistungsfähiges Werkzeug, das das Wachstum großer 2D-Kristalle für Strukturstudien biologischer Makromoleküle erleichtert. Um eine intakte Lipidmonoschicht an der Luft-Wasser-Grenzfläche erfolgreich vorzubereiten, wird dringend empfohlen, die Lipide am Tag des Experiments frisch aufzubereiten, da eine Oxidation der Lipid-Acylkette zu einer Packungsstörung in der Monoschicht führen und die resultierende Kristallbildung beeinträchtigen könnte. Gekaufte Lipide in Pulverform sollten mi…

Materials

14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipets	Fisher Scientific	03-448-21
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Desiccator vacuum	Southern Labware	55207
EM grids	Electron Microscopy Sciences	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)	Hamilton Company	80465
Hamilton syringe (250 µL)	Hamilton Company	81165
Hamilton syringe (5 µL)	Hamilton Company	87930
Hamilton syringe (500 µL)	Hamilton Company	203080
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Petri dish	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
Teflon block	Grainger	55UK05	60 µL wells with side injection ports, manually made
Tweezers	Electron Microscopy Sciences	78325	Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleaner	VWR	97043-996