Summary
脂質単層は、構造研究のための2次元(2D)タンパク質結晶を形成するための基礎として何十年も使用されてきました。それらは空気水の界面で安定しており、電子のイメージ投射のための薄い支持材料として役立つことができる。ここでは、生物学的研究のための脂質単層を調製するための実証済みのステップを紹介します。
Abstract
電子結晶学は、高解像度の構造決定のための強力なツールです。可溶性または膜タンパク質などの高分子は、好条件下で高度に順序付けられた二次元(2D)結晶に成長させることができます。成長した2D結晶の品質は、2D画像処理による最終的な再構成の分解能にとって非常に重要です。脂質単層は、末梢膜タンパク質や可溶性タンパク質の2D結晶化を促進する支持層として長年にわたり使用されてきました。この方法は、一体膜タンパク質の2D結晶化にも適用できますが、単層への仕切りを促進するために洗剤および透析条件を決定するために、より広範な経験調査が必要です。脂質単層は、水相および非極性のアシル鎖、尾部が空気中に仕切り、表面張力を破り、水面を平らにするような、空気水界面に形成される脂質一層である。頭部群の荷電性または特徴的な化学部分は、溶液中のタンパク質に親和性を提供し、2Dアレイ形成のための結合を促進する。2Dアレイを備えた新しく形成された単層は、結晶アレイを持ち上げて支持するために使用されるカーボンコート銅格子上の電子顕微鏡(EM)に容易に移動することができる。本研究では、極低温電子顕微鏡(クライオ-EM)イメージングのための脂質単層法学的方法論を説明する。
Introduction
2D結晶またはタンパク質のヘリカルアレイを介した電子回折は、好ましい症例1、2、3においてサブナノメートル分解能を達成することができる。特に興味深いのは、2D膜タンパク質アレイまたは結晶をほぼネイティブ環境で再構成する1.結晶は特定の空間周波数での構造因子の強度を高める信号増幅器として機能するため、電子結晶学は、単粒子クライオEMよりも小分子などの高解像度で小さいサイズのターゲットを探査することを可能にします。電子ビームは、順序付けられた2Dアレイのタンパク質によって回折することができ、画像面が検出器4に記録される場所に応じて回折パターンまたは格子画像を生成する。回折強度を抽出し、結晶の2D投影構造を再構築するために処理することができます。電子はX線よりも大きな散乱断面を有し、その散乱は主に分子5内の電子と荷電原子とのクーロン相互作用に基づくラザフォードモデルに従う。2D膜結晶の厚さは、通常100nm未満であり、試料6内で動的散乱が起きることなく電子透過に適している。電子結晶学的研究は、膜タンパク質および脂質タンパク質相互作用の高分解能構造情報を7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17に対して強力なツールとして得ることを示している。
脂質単層は、空気水界面6で密に詰められたリン脂質からなる1つの脂質層であり、可溶性タンパク質または末梢膜タンパク質18に対する2Dアレイ形成を補助することができる。脂質の密度とそれらの横圧に応じて、脂質分子は、水溶液1、6、19に露出したアシル鎖および親水性ヘッドグループに拡張された空気と水界面に秩序ある2Dアレイを形成することができる。脂質ヘッドグループは、静電相互作用を介してタンパク質と相互作用することができ、または特定のタンパク質ドメインに結合する親和性タグを提供するように改変することができる。例えば、DOGS-NTA-Ni(1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノジ酢酸)2-Ni2+]は、ポリヒスチジンタグ20、21、22でタンパク質を結合する脂質単層を形成する際によく使用される。また、コレラ毒素Bは、構造研究23,24のための脂質単層にガングリオシドGM1の特定の五糖類を結合することができる。脂質のヘッドグループにタンパク質を固定することにより、脂質単層は、高解像度の電子結晶学的研究のために薄い2Dアレイの形成を支援することができます。脂質単層法は、ストレプトアビジン2、25、アネキシンV26、コレラ毒素27、大腸菌ジラーゼBサブユニット28、大腸菌RNAポリメラーゼ25、29、30、カルボキシ性シェルタンパク質31およびHIV-12血糖血症のタンパク質の構造研究のために電子結晶学に使用されてきた33.脂質単層の安定性と化学的性質のために、サンプル調製のための異なる用途がクライオEMイメージング34のために検討されている。しかし、タンパク質アレイ形成には最適化が必要です。
ここでは、クライオEMイメージングのための脂質単層の一般的な調製の詳細と、形成された単層の品質に影響を与える可能性のあるいくつかの考慮事項を提供します。
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Protocol
1. テフロンブロックの準備
- 耐薬品性PTFE(ポリテトラフルオロエチレン)樹脂からテフロンブロックを調製します。一般的なドリルを使用してブロックに穴を開け、その後に 図 1に示した寸法を使用します。
2. 単層脂質製剤
注:推定動作時間:30〜45分
- 脂質ストック調製
- 0.01 mg/mL 脂質混合物を、クロロホルム 8.91 mL、メタノール 0.99 mL、10 mg/mL の脂質の 0.01 mL を使用して、9:1 (v/v) クロロホルム/メタノールで調製します。
- テフロンプレート調製
- メタノールバスでテフロンプレートを5分間超音波処理します。
- お湯で15分洗います。
- 蒸留水ですすります。
- テフロンプレートをデシケータで30分間乾燥させ、使用していないときに真空下に置いてください(図1)。
3. バッファーリザーバー上の脂質単層の形成
注:推定動作時間:1.5時間
- 実験当日にクロロホルム/メタノールの9:1混合物に0.01mg/mLの脂質混合物を作り上げます。
- ペトリ皿にタイプ1のフィルターペーパーを入れ、フィルターペーパーの上にテフロンブロックを並べます。
- テフロンプレートのウェルに60 μLのバッファーを充填します。
- ハミルトンシリンジを使用して、バッファー表面のドロップ(理想的には1 μL/ドロップ)の上に脂質混合物を慎重に追加します。
- ペトリ皿の湿度を保つために蒸留水でフィルター紙を濡らします。
- 室温で60分間インキュベートします。クロロホルムは蒸発し、バッファーの表面に脂質の単層が形成されるべきである。
4. 脂質単層上のEMグリッドの適用
注:推定動作時間:1.5時間
- グロー放電なしで、カーボンサイドダウン、各バッファーリザーバの上部に、穴のあいたカーボンコーティングされたEMグリッドを穏やかに配置します。
- 慎重にサイドインジェクションによくタンパク質を注入.1 μM前後のタンパク質の井戸内の最終的なタンパク質濃度を出発点として使用します。実験前にタンパク質濃度を事前に最適化します。
- 室温で60分間インキュベートします。
- 約20~30μLのバッファーをサイドインジェクションポートに静かに注入します。これにより、グリッドがテフロン ブロックのサーフェスの上に上がります。
- すぐにトゥイザーでグリッドを拾い、液滴から垂直に持ち上げます。
- 負の染色またはクライオ-TEMイメージング用の単層サンプルを準備する(図2)。タンパク質が2Dアレイを形成する場合、画像パワースペクトルまたはフーリエ歯級数は、結晶対称性に基づいて空間周波数で回折強度を示します。パワースペクトルに回折スポットが見えない場合、タンパク質が2D結晶を形成する可能性は低い。
- 透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて、EMグリッド上の脂質単層の被覆範囲を確認します。下方拡大された電子画像は、被覆単層の形態を識別するのに役立ちます。通常、単層で覆われた領域の画像コントラストは、被覆領域のコントラストよりもわずかに低くなります。さらに、計算された2D画像パワースペクトルは、2D結晶の位置を特定するのに役立ちます。
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Representative Results
EMグリッド上に堆積した脂質単層は、染色せずに透過型電子顕微鏡(TEM)下で可視化することができる。この単層存在は、ビーム経路に標本を含まない領域とのコントラスト差によって認識することができる。脂質単層被覆率の領域は、空のホールを通る電子ビームは散乱がなく、明るい照明を示すため、カバレッジのない領域よりも局所的なコントラストが低い(図3)。
2D単層結晶化の条件をスクリーニングするには、陰性染色EMまたはクライオEMイメージングを使用して検体の画像を調べる。単層が穴を覆うかどうかは、ステージが傾いたときにより強いエッジコントラストによって観察することができる。結晶が形成されている場合、画像のパワースペクトルまたは歯角はフーリエまたは回折スポットを示します。小さいサイズ(<200 nm)およびランダムに配向された結晶は、パワースペクトルに高輝度のリングを示し得る。結晶が成長していない場合、パワースペクトルはフーリエスポットを表示しません。
図 1.脂質単層形成に使用されるテフロンブロック。 テフロンブロックは、上(上)と断面(下)のビューに表示されます。それは6行と2列に配置された12の井戸が含まれています。Aというラベルが付いたメインバッファは、真ん中に直径4mm、深さ5mm、60 μLのサンプルボリュームです。この単層は、メインウェルのバッファーリザーの上に形成され、タンパク質は、水色で示されるBとラベル付けされた側ポートを介して注入される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.脂質単層上の2D結晶の開発の概略発表。 バッファーリザーバーは、まずバッファーで満たされ、次いで、ウェルの上に堆積した脂質が続きます。EMグリッドの炭素側は、疎水性の尾と相互作用する脂質単層に配置されます。まず、タンパク質をサイドインジェクションウェルBを介して注入する(ステップ1)。時間が経つにつれて、タンパク質は2D結晶格子に配置され、脂質ヘッド基と相互作用する(ステップ2)。さらなる分析のためにEMグリッドをピックアップするには、ツイーザーを使用して、グリッドをバッファリザーから垂直に持ち上げます(ステップ3)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.EMグリッド上の脂質単層被覆の例。 フィリップスCM12透過電子顕微鏡を室温で使用して、染色せずに単層および正孔カーボンコートEMグリッドを画像化しました。オレンジ色の矢印は、脂質単層カバレッジがない領域を示し、青い矢印はグリッドホール内の脂質単層の完全なカバレッジを示します。スケールバーは0.5 μmです。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
脂質単層は、生体高分子の構造研究のための大きな2D結晶の成長を促進する強力なツールです。空気と水の界面で無傷の脂質単層を作製するには、実験当日に脂質を新たに調製することを強く推奨します。粉末形態で購入した脂質は、リン脂質35を溶解するために一般的に使用されるクロロホルム:メタノール溶媒の混合物を使用して溶解する必要があります。クロロホルム:メタノール溶媒は、あらかじめ作製し、密閉ガラスバイアルに保存することができます。溶存脂質は空気と水の界面で適用されますが、クロロホルム:メタノール溶媒がバッファーから完全に蒸発するまで待ちます。この実験では、脂質単層の形成と2D結晶の形成に必要不可欠な時間です。典型的には、脂質単層および2Dアレイの形成は、インキュベーション時間18の約30〜60分以内に行うことができる。
脂質単層が適切に形成される場合には、2D結晶アレイ形成が脂質によって効果的に促進されることを確認する。特にDOGS-NTA-Ni脂質が18,36を使用する場合、バッファ組成物は2Dアレイの確立を安定させるために最適化されるべきです。この脂質に対する脂質単層結晶化の成功は、高濃度のEDTA(エチレンアミンテアセテート)、DTT(1,4-ジチオトライトール)、または緩衝液内の各種イオンが存在する場合に影響を受ける可能性があります。可溶性キレートEDTAは、脂質金属イオンタンパク質複合体36を破壊し得る。この一例は、イミノジオ酢酸Cu(II)脂質とのストレプトアビジンタンパク質相互作用;EDTAの添加はCu(II)を除去し、脂質金属イオンタンパク質複合体20を割り込む。したがって、サンプルは、EDTAを除去するために希釈またはバッファー交換する必要があり、タンパク質の結合を強くし、結晶形成を促進する必要があります。バッファの最適化は、Teflon ブロックのバッファ リザーバに追加する前に行う必要があります。
2D結晶の高解像度の構造詳細を維持するには、試料の平坦性を維持することが重要です。しかしながら、表面張力、試料と支持体または人的介入との間の差圧熱容量のために、試料移送中に2D結晶の平坦性を維持することは容易ではない。EMグリッドがバッファリザーバから持ち上げられると、単層インターフェースをそのまま残すために、可能な限り少ない妨害で動作する必要があります。グリッドの急激な回転や動きは、単層インタフェースを破壊する可能性があります。これは、結晶を含むグリッドを注意して処理し、氷の結晶を避けるために急速に凍結する必要があり、新たに形成された2Dタンパク質結晶を損傷する可能性があるサンプル凍結ステップにも当てはまります。
1つは、レースカーボンフィルムの穴のサイズに応じて、異なるサイズの単層をサポートするために、レース状のカーボンコーティングされたグリッドを使用することができます。単層界面の平坦性は、レース状の炭素膜上の様々な穴サイズの影響を受ける可能性があり、これは等方性方向の回折強度を有する平坦な単層をスクリーニングするのに役立つ可能性がある。
構造研究のために2D結晶を成長および発達させるために用いられる4つの一般的な方法があります:透析、希釈、疎水性吸着および脂質単層37、38、39。透析法は、精製の初期段階で膜タンパク質を可溶化するために使用される洗剤を除去します。2D結晶は、良好な条件下で、洗浄剤可溶化膜タンパク質を脂質二重層に再構成することによって成長する35。再構成が行われるには、透析によって洗剤を取り除く必要があります。従って、透析法は、2D結晶40の形成を駆動するのに役立つ。しかし、透析法は、特に重要なミセル濃度が小さい洗剤(CMC)に対しては、通常時間がかかる。2Dアレイの形成は、制御された希釈によっても達成することができる。この方法は、そのCMCを下回る洗浄剤濃度が低下した場合に結晶形成を誘導するタンパク質・脂質・洗剤混合物に対する設定比を提供する。これは、より高い初期タンパク質濃度41から始まる作業を行うために特定の希釈機によって容易にすることができる。加えて、疎水性吸着は、ポリスチレンビーズ(例えば、バイオビーズ)を用いて低CMC洗剤42を除去することにより、2D結晶の成長を促す。目的のタンパク質が高いCMC洗剤で可溶化する場合、この方法は理想的ではありません。対照的に、脂質単層法は汎用性が高く、2D結晶化43のための非複雑な工程を提供する。ここで説明したように、実験を行うには簡単な装置といくつかの材料が必要です。我々の方法では、実験に必要な合計時間を4時間17に短縮することができる。タンパク質濃度やバッファー成分などの特定のパラメータの事前最適化が必要な場合でも、日常的なラボ作業で効率を最大化することは可能です。
脂質単層を用いて一体型膜タンパク質を結晶化する場合、可溶化タンパク質および脂質の洗浄剤濃度が単層界面を乱すかどうかをテストする必要があります。一般的に、CMC 44よりも低い洗浄剤濃度を使用することが推奨される。単層界面が洗剤の存在に敏感である場合、代替アプローチは、フルオロ脂質を用いて脂質単層を形成し、これは洗剤によって可溶化し難く、単層法45を用いて一体膜タンパク質結晶化の適用可能性を拡大することができる。
脂質単層法は単純でコストが低いが、単層製剤の再現性は、周囲湿度や温度などの様々な要因に依存する。クライオEMイメージングのためのサンプル転送の成功は、慎重な標本処理に依存しています。初心者や新しい研究プロジェクトの最初の段階で高解像度の結果を得ることが難しい場合もあります。
結論として、脂質単層法は、その単純性のためにタンパク質構造を研究する機会を提供する。2D結晶形成のプロセスを容易にする代替アプローチを提供してもよい。
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Disclosures
著者は宣言する利害の対立はありません。
Acknowledgments
この原稿の作成は、部分的に米国陸軍研究事務所(W911NF2010321)とアリゾナ州立大学のスタートアップ資金P.-L.Cに支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
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