Provberedning med lipidmonalayermetod för elektronkristallkroografiska studier
Summary
Lipidmonoskikt har använts som grund för att bilda tvådimensionella (2D) proteinkristaller för strukturella studier i årtionden. De är stabila vid luft-vatten-gränssnittet och kan fungera som ett tunt stödmaterial för elektronavbildning. Här presenterar vi de beprövade stegen för att förbereda lipidmonoskikt för biologiska studier.
Abstract
Elektronkristallografi är ett kraftfullt verktyg för högupplösningsstrukturbestämning. Makromolekyler som lösliga eller membranproteiner kan odlas till högbeställda tvådimensionella (2D) kristaller under gynnsamma förhållanden. Kvaliteten på de odlade 2D-kristallerna är avgörande för upplösningen av den slutliga återuppbyggnaden via 2D-bildbehandling. Under årens lopp har lipidmonoskikt använts som ett stödjande skikt för att främja 2D-kristallisering av perifera membranproteiner samt lösliga proteiner. Denna metod kan också tillämpas på 2D-kristallisering av integrerade membranproteiner men kräver mer omfattande empirisk undersökning för att bestämma tvättmedel och dialys villkor för att främja partitionering till monolayer. En lipidmonalayer bildas vid luft-vattengränssnittet så att polarläpphuvudgrupperna förblir hydratiserade i vattenfasen och de icke-polära, aylkedjorna, svansarna delar sig i luften, bryter ytspänningen och plattar ut vattenytan. Huvudgruppernas laddade natur eller distinkta kemiska moieties ger affinitet för proteiner i lösning, vilket främjar bindning för 2D-matrisbildning. Ett nybildat monoskikt med 2D-matrisen kan lätt överföras till ett elektronmikroskop (EM) på ett kolbelagt kopparnät som används för att lyfta och stödja den kristallina matrisen. I detta arbete beskriver vi en lipid monolayer metodik för kryogena elektron mikroskopisk (cryo-EM) imaging.
Introduction
Elektrondiffraktion genom 2D-kristaller eller spiralformade matriser av proteiner kan uppnå sub nanometerupplösning igynnsamma fall 1,2,3. Av särskilt intresse är rekonstituerade 2D-membranproteinmatriser eller kristaller i deras nära infödda miljöer1. Eftersom en kristall fungerar som en signalförstärkare som förbättrar intensiteten hos de strukturella faktorerna vid specifika rumsliga frekvenser, gör elektronkristallografi det möjligt att sondera ett mål med en mindre storlek vid höga upplösningar, såsom små molekyler, än de för enpartikel cryo-EM. Elektronstrålen kan diffracted av en ordnad 2D-samling proteiner, vilket genererar ett diffraktionsmönster eller en gitterbild beroende på var bildplanet registreras pådetektorn 4. De diffracted intensiteterna kan sedan extraheras och bearbetas för att rekonstruera en 2D-projektionsstruktur av kristallen. Elektroner har ett större spridningssnitt än röntgenstrålar och dess spridning följer mestadels Rutherford-modellen baserat på Coulomb-interaktionen mellan elektronerna och de laddade atomerna imolekylen 5. Tjocklekarna på 2D-membrankristaller är vanligtvis mindre än 100 nm, lämpliga för elektronöverföring utan dynamisk spridning som förekommer inom prov6. Elektronkristallografiska studier har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för att undersöka högupplöst strukturell information om membranproteiner och lipidproteininteraktioner7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
En lipidmonalayer är ett enda lipidskikt bestående av fosfolipider tätt packade vid ett luftvattengränssnitt6, vilket kan hjälpa 2D-matrisbildningen för lösliga proteiner eller perifera membranproteiner18. Beroende på lipidens densitet och deras laterala tryck kan lipidmolekylerna bilda en ordnad 2D-matris på luft-vattengränssnittet med sina asylkedjor som är utsträckta till luft- och hydrofila huvudgrupper som exponeras ivattenlösningen 1,6,19. Lipidhuvudgruppen kan interagera med proteiner via elektrostatisk interaktion eller kan modifieras för att ge en affinitetstagg för att binda en specifik proteindomän. Till exempel används DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn -glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) ofta för att bilda en lipidmonalayer för att binda proteinerna med en poly-histidin tagg20,21,22. Koleratoxin B kan också binda en viss pentasackarid av ganglioside GM1 i en lipidmonalayer för strukturella studier23,24. Genom att förankra proteinerna på lipidhuvudgrupperna kan lipidmonoskiktet hjälpa bildandet av de 2D-matriser som är tunna för högupplösta elektronkristallografiska studier. Lipidmonoskiktstekniken har använts i elektronkristallografi för strukturella studier av proteiner, såsom streptavidin2,25, annexin V26, koleratoxin27, E. coli gyrase B underavdelning28, E. coli RNA polymeras25,29,30, karbinom skalproteiner31 och kapsidproteinerna i HIV-132 och Moloney murin leukemi virus 33.På grund av lipidmonaggarens stabilitet och kemiska egenskaper har olika tillämpningar för provberedning undersökts för cryo-EM imaging34. Optimering kommer dock att behövas för proteinmatrisbildning.
Här ger vi omfattande detaljer om den allmänna förberedelsen av lipidmonoskikt för cryo-EM-avbildning och några överväganden som kan påverka kvaliteten på de bildade monoskikten.
Protocol
Representative Results
Discussion
En lipidmonalayer är ett kraftfullt verktyg som underlättar tillväxten av stora 2D-kristaller för strukturella studier av biologiska makromolekyler. För att framgångsrikt förbereda en intakt lipidmonalayer vid luft-vattengränssnittet rekommenderas starkt att lipiderna framställs ny på experimentets dag, eftersom oxidering av lipidasylkedjan kan leda till förpackningsstörningar i monoskiktet och påverka den resulterande kristallbildningen negativt. Inköpta lipider i pulverform bör lösas upp med en blandnin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Förberedelsen av detta manuskript stöddes delvis av US Army Research Office (W911NF2010321) och Arizona State University startfonder till P.-L.C.
Materials
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
References
- Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
- Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography. Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).
- Braun, T., Engel, A. Two-dimensional electron crystallography. Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).
- Wang, H. -. W., Wang, J. -. W. How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other. Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).
- Williams, D. B., Carter, C. B. . Transmission electron microscopy. , (2016).
- Abeyrathne, P. D., et al. 1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy. Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).
- Muller, M. P., et al. Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation. Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).
- Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components. Frontiers in Plant Science. 7, 1322 (2016).
- Hite, R. K., Chiu, P. -. L., Schuller, J. M., Walz, T. Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0. PloS One. 10 (1), 0117371 (2015).
- Murata, K., et al. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).
- Schenk, A. D., et al. The 4.5 A structure of human AQP2. Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).
- Gonen, T., et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).
- Hiroaki, Y., et al. Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion. Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).
- Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore. Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).
- Chiu, P. -. L., et al. The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution. Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).
- Kowal, J., et al. Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1. Nature Communications. 5, 3106 (2014).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).
- Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples. Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).
- Pal, S. Chapter 6 – Structure analysis and visualization. Fundamentals of Molecular Structural Biology. , 119-147 (2020).
- Frey, W., et al. Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).
- Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid. Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).
- Vénien-Bryan, C., et al. Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid. Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).
- Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L’Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).
- Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography. Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).
- Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers. Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).
- Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution. Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).
- Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane. Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).
- Celia, H., et al. Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films. Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).
- Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).
- Schultz, P., et al. Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals. Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).
- Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals. Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).
- Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer. The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).
- Barklis, E., et al. Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins. The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).
- Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).
- Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).
- Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).
- Dietrich, J., nien-Bryan, C. . Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers. , (2005).
- Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation. BioMed Research International. 2015, 693869 (2015).
- De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -. M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment. Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).
- Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography. Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).
- Rémigy, H. -. W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution. FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).
- Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins. Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).
- Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Lebeau, L., et al. Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer. Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).
