인간 비강 상피 오가노이드의 문화와 이미징
Summary
상세한 프로토콜이 인간 비강 상피 세포로부터의 시험관내 오가노이드 모델을 기술하기 위해 여기에 제시된다. 이 프로토콜에는 표준 실험실 장비가 필요한 측정 옵션이 있으며 특수 장비 및 소프트웨어에 대한 추가 가능성이 있습니다.
Abstract
낭포성 섬유증 (CF) 환자에 대한 개별화 된 치료는 기준선 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기 (CFTR) 활성 및 소분자 화합물로부터의 복원을 이해하기 위해 시험관 내 질병 모델로 달성 될 수 있습니다. 우리 그룹은 최근 일차 인간 비강 상피 세포 (HNE)에서 직접 파생 된 잘 분화 된 오가노이드 모델을 수립하는 데 중점을 두었습니다. 절편된 오가노이드의 조직학, 전체 탑재 면역형광 염색 및 이미징(공초점 현미경, 면역형광 현미경 및 밝은 필드 사용)은 기능적 분석에 대비하여 오가노이드를 특성화하고 상피 분화를 확인하는 데 필수적입니다. 또한, HNE 오가노이드는 CFTR 활성과 상관 관계가 있는 다양한 크기의 루멘을 생성하며, CF와 비-CF 오가노이드를 구별합니다. 이 원고에서는 HNE 오가노이드를 배양하기위한 방법론이 자세히 설명되어 있으며, 기준선 루멘 면적 측정 (현미경을 사용하는 모든 실험실에서 사용할 수있는 오가노이드에서 CFTR 활성 측정 방법)을 포함한 이미징 양식을 사용한 분화 평가뿐만 아니라 기능 분석에 대한 개발 된 자동화 된 접근법 (더 전문화 된 장비가 필요함)에 중점을 둡니다.
Introduction
기술 소개
Ex vivo 배양 기반 분석은 정밀 의학 및 질병 병리 생리학 연구에 점점 더 많이 활용되는 도구입니다. 일차 인간 비강 상피 (HNE) 세포 배양은 낭포성 섬유증의 수많은 연구에 사용되어 왔으며 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , 여러 장기에서 상피 세포 기능에 영향을 미치는 상염색체 열성 질환. HNE 배양은 전향적으로 얻을 수 있는 기도 상피의 재생 가능한 공급원을 제공하고 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절기(CFTR) 활성을 시험하기 위해 전기생리학적 및 생화학적 특성을 되풀이합니다. HNE 세포는 일반적인 바이러스성 호흡기 면봉과 유사한 최소한의 부작용(14)으로 샘플링될 수 있다. HNE 브러쉬 생검으로부터 유래된 낭포성 섬유증 연구에 대한 모델을 기술하는 연구 작업은 최근11,13에 발표되었다. 일차 HNE2,3 및 장 조직15,16,17,18,19를 사용하는 다른 모델과 유사하지만, CF 연구에 사용하고 다른 기도 질환의 연구를 돕기 위해 이 모델의 분화 및 영상화에 대한 상세한 특성화가 여기에 기술되어 있다 13 . 오가노이드 모델은 불멸화된 세포주처럼 무제한이 아니지만, 조건부 재프로그래밍(조사되고 불활성화된 피더 섬유아세포 및 Rho-kinase 억제제 사용)에 의해 보다 줄기 세포 유사 상태20,21,22,23으로 확장될 수 있다. 이 방법을 사용하여 HNE 브러쉬 생검을 처리하면 완전히 분화 할 수있는 능력을 유지하면서 더 높은 처리량으로 여러 응용 분야에서 사용할 수있는 많은 수의 상피 세포가 생성됩니다. 이 프로토콜이 피더 세포를 사용하여 개발되었지만, 피더 세포 기술(14,24)을 피하고자 하는 조사자들에 의해 다른 방법론들이 사용될 수 있다.
폐 생물학에 대한 기술의 중요성
중요한 연구는 상피 세포의 세포막에 규칙적이고 기능하는 CFTR이 없으면 폐, 췌장, 간, 장 또는 기타 조직에서 어떻게 기능 장애를 초래하는지 이해하는 데 전념했습니다. 기능 장애가있는 상피 이온 수송, 특히 염화물과 중탄산염의 상피 이온 수송은 상피 라이닝 유체의 부피가 감소하고 점액 분비물의 변화를 일으켜 점액 정체 및 폐색으로 이어집니다. 원발성 섬모 운동 이상증과 같은 다른 기도 질환에서, 변경된 섬모 운동은 점액 클리어런스를 손상시키고 점액 정체 및 폐색(25)을 초래한다. 따라서, 현재의 HNE 오가노이드 모델은 조사자의 실험 설계 및 자원에 따라 다양한 응용을 위해 개발되고 있다. 여기에는 살아있는 세포 얼룩을 이용한 살아있는 세포 이미징이 포함됩니다. 형태학을 특성화하기 위한 고정 및 단면화; 항체로 면역 형광 염색 및 발광 내 구조를 파괴하는 것을 피하기 위해 전체 마운트 공초점 이미징; 및 섬모 비트 빈도 및 점액 수송의 정량적 측정을 위한 밝은 장 이미징 및 마이크로 광학 간섭 단층 촬영(13). 다른 조사자로의 확장을 용이하게 하기 위해, 상업적으로 이용가능한 시약 및 공급물을 배양에 사용하였다. 일반적인 현미경 기술과 더 전문화 된 장비를 사용하는 기능적 분석이 개발되었습니다. 전반적으로, 본 모델은 기준선에서 또는 치료제에 반응하여 CFTR 활성을 평가하도록 설계된 반면, 이 프로토콜에 기술된 기술은 상피 세포 기능, 특히 상피 세포 유체 수송을 수반하는 다른 질환에 적용될 수 있다.
다른 방법론과의 비교
최근에 이 오가노이드 모델의 유용성은 환자의 오가노이드의 시험관내 CFTR 조절제 반응을 그들의 임상 반응(11)과 상관관계에 의해 개발되었다. 특히, 본 모델이 동일한 환자에서 CFTR 기능을 평가하기 위한 현재의 황금 표준인 단락 전류 반응을 병렬화했다는 것도 입증되었다. 단락 전류는 전자가 이온 수송(26)을 통해 CFTR 기능을 측정하기 때문에 팽윤 분석과 다르다. 대조적으로, 이 분석은 유체 수송을 통한 더 많은 다운스트림 효과를 측정하여, CFTR 27,28,29,30,31,32의 전체 기능에 대한 추가 정보를 제공한다. 단락 전류 측정은 CFTR 염화물 채널 활성 1,33을 결정하기 위한 일반적이고 신뢰할 수 있는 방법임이 계속되고 있다. 이러한 전기생리학적 분석은 전문화되고 값비싼 장비가 필요하며, 오가노이드 분석법보다 각 실험 복제에 대해 몇 배 더 많은 세포를 필요로 하며, 쉽게 자동화할 수 없으며, 더 높은 처리량 애플리케이션을 위해 확장이 불가능하다. 장 상피로부터 유래된 또 다른 오가노이드 모델은 보다 우수한 복제 능력과 같은 추가적인 이점 15,16,17,18을 갖지만, 기도 조직으로부터 유래되거나 보편적으로 이용가능하지 않다. HNE 칫솔질은 진정 작용이 필요없고 최소한의 위험으로 저렴한 세포학 브러시로 얻을 수 있습니다. 양치질을 얻는 것은 임상의가 필요하지 않으며 훈련 된 연구 코디네이터 및 다른 연구 직원(14)에 의해 수행 될 수있다. HNE 오가노이드 모델은 일차 세포 배양 능력을 가진 모든 실험실에서 배양할 수 있으며, 일부 용도는 표준 현미경 기술로 수행할 수 있습니다. 전체적으로 이러한 장점은 일부 실험실에서 사용할 수없는 기도 상피 기능을 평가하기위한 기술에 대한 추가 액세스를 제공합니다. 또한, HNE 오가노이드는 장내 오가노이드가 할 수 없는 원발성 섬모 운동이상증25 또는 바이러스 감염과 같이 기도에 영향을 미치는 다른 질병 상태를 연구하는데 이용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 HNE 브러시 생검에서 유래 된기도 상피 오가노이드의 포괄적 인 라이브 및 고정 이미징을위한 상세한 방법론을 제공합니다. 그것은 개체에서 CFTR 활성을 결정할 수있는 기능적 분석을 설명합니다. HNE는 다양한 용도를 위한 최소 침습성 일차 조직을 제공합니다. 여기에 제공된 확장 기술은 오가노이드를 포함한 기도 질환을 모델링하는 데 사용될 수 있습니다. 오가노이드는 정밀한 치료 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 프로토콜을 개발하기 위해 HNE 브러시 생검을 기증 한 모든 참가자의 기여에 감사드립니다. 연구 자원 봉사자 모집 및 샘플 수집을 조정해 주신 Latona Kersh와 Children’s Research Unit 직원에게 감사드립니다. 릴리 덩, 조나단 베일리, 그리고 우리 실험실의 전 연수생이었던 스티븐 맥케이에게 기술 지원에 감사드립니다. 우리는 Zhong Liu와 Rui Zhao에게 기술적 인 도움을 주셔서 감사합니다. UAB의 CF 연구 센터 책임자 인 Steven M. Rowe는 리더십과 자원을 제공하며,이 없이는 이러한 작업이 불가능합니다. 또한 Biotek의 Sarah Guadiana에게 계측기 훈련 지원을 해준 Sarah Guadiana, UAB 고해상도 이미징 시설에서 공초점 현미경 검사 지원을 해준 Robert Grabski, UAB Histology Core에서 조직학적 지원을 해준 Dezhi Wang에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 보건원 (NIH)의 지원을 받았습니다. 그랜트 K23HL143167 (JSG에), 낭포성 섬유증 재단 (CFF) 그랜트 GUIMBE18A0-Q (JSG에), 그레고리 플레밍 제임스 낭포성 섬유증 센터 [NIH 그랜트 R35HL135816 및 DK072482 및 버밍엄 앨라배마 CFF 대학 (UAB) 연구 개발 프로그램 (Rowe19RO)], UAB 임상 및 번역 과학 센터 (NIH 그랜트 UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. . CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. . Lionheart FX Live Cell Imager Operator’s Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
