Kultur und Bildgebung von humanen nasalen Epithelorganoiden
Summary
Hier wird ein detailliertes Protokoll vorgestellt, um ein in vitro Organoidmodell aus menschlichen Nasenepithelzellen zu beschreiben. Das Protokoll bietet Optionen für Messungen, die Standardlaborgeräte erfordern, mit zusätzlichen Möglichkeiten für spezielle Geräte und Software.
Abstract
Eine individualisierte Therapie für Mukoviszidose-Patienten (CF) kann mit einem In-vitro-Krankheitsmodell erreicht werden, um die Aktivität des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) und die Wiederherstellung aus niedermolekularen Verbindungen zu verstehen. Unsere Gruppe konzentrierte sich kürzlich auf die Etablierung eines gut differenzierten Organoidmodells, das direkt von primären menschlichen Nasenepithelzellen (HNE) abgeleitet ist. Die Histologie der geschnittenen Organoide, die Ganzkörper-Immunfluoreszenzfärbung und die Bildgebung (unter Verwendung von konfokaler Mikroskopie, Immunfluoreszenzmikroskopie und Hellfeld) sind unerlässlich, um Organoide zu charakterisieren und die epitheliale Differenzierung in Vorbereitung auf funktionelle Assays zu bestätigen. Darüber hinaus produzieren HNE-Organoide Lumen unterschiedlicher Größe, die mit der CFTR-Aktivität korrelieren und zwischen CF- und Nicht-CF-Organoiden unterscheiden. In diesem Manuskript wird die Methodik zur Kultivierung von HNE-Organoiden ausführlich beschrieben, wobei der Schwerpunkt auf der Beurteilung der Differenzierung unter Verwendung der Bildgebungsmodalitäten liegt, einschließlich der Messung der Ausgangslumenfläche (eine Methode zur CFTR-Aktivitätsmessung in Organoiden, die jedes Labor mit einem Mikroskop anwenden kann) sowie des entwickelten automatisierten Ansatzes für einen funktionellen Assay (der speziellere Ausrüstung erfordert).
Introduction
Einführung in die Technik
Ex-vivo-kulturbasierte Assays sind ein zunehmend eingesetztes Werkzeug für die Präzisionsmedizin und das Studium der Krankheitspathophysiologie. Primäre humane Nasenepithel-Zellkultur (HNE) wurde in zahlreichen Studien zur Mukoviszidoseverwendet 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , eine autosomal-rezessive Erkrankung, die die Funktion von Epithelzellen in mehreren Organen beeinträchtigt. Die HNE-Kultur bietet eine erneuerbare Quelle für Atemwegsepithele, die prospektiv erhalten werden kann und elektrophysiologische und biochemische Eigenschaften rekapituliert, um die Aktivität des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) zu testen. HNE-Zellen können mit minimalen Nebenwirkungen14 beprobt werden, ähnlich wie bei herkömmlichen viralen Atemwegsabstrichen. Forschungsarbeiten, die ein Modell für Mukoviszidose-Studien beschreiben, die von HNE-Bürstenbiopsien abgeleitet wurden, wurden kürzlichveröffentlicht 11,13. Während ähnlich wie bei anderen Modellen, die primäres HNE2,3 und Darmgewebe15,16,17,18,19 verwenden, werden hier detaillierte Charakterisierungen der Differenzierung und Bildgebung dieses Modells für den Einsatz in der CF-Forschung und zur Unterstützung bei der Untersuchung anderer Atemwegserkrankungen beschrieben 13 . Das Organoidmodell ist nicht unbegrenzt wie immortalisierte Zelllinien, sondern kann durch bedingte Reprogrammierung (unter Verwendung von bestrahlten und inaktivierten Feeder-Fibroblasten und Rho-Kinase-Inhibitoren) auf einen stammzellähnlicheren Zustand20,21,22,23 erweitert werden. Die Verarbeitung von HNE-Bürstenbiopsien mit dieser Methode ergibt eine große Anzahl von Epithelzellen, die in mehreren Anwendungen bei höherem Durchsatz eingesetzt werden können, während gleichzeitig die Fähigkeit zur vollständigen Differenzierung erhalten bleibt. Während dieses Protokoll unter Verwendung von Feederzellen entwickelt wurde, können andere Methoden von Forschern verwendet werden, die die Feederzelltechnologie vermeiden möchten14,24.
Bedeutung der Technik für die Lungenbiologie
Eine bedeutende Studie wurde dem Verständnis gewidmet, wie das Fehlen von regelmäßiger, funktionierender CFTR in der Zellmembran von Epithelzellen zu Funktionsstörungen in der Lunge, der Bauchspeicheldrüse, der Leber, dem Darm oder anderen Geweben führt. Ein dysfunktionaler epithelialer Ionentransport, insbesondere der von Chlorid und Bicarbonat, führt zu einem verringerten Volumen der epithelialen Auskleidungsflüssigkeiten und zu Veränderungen der Schleimsekrete, was zu Schleimbildung und Obstruktion führt. Bei anderen Atemwegserkrankungen, wie der primären ziliären Dyskinesie, beeinträchtigt eine veränderte Ziliarbewegung die mukoziliäre Clearance und führt zu Schleimhautstauung und Obstruktion25. Daher wurde das aktuelle HNE-Organoidmodell für verschiedene Anwendungen entwickelt, abhängig vom experimentellen Design und den Ressourcen des Prüfers. Dazu gehört die Lebendzellbildgebung unter Verwendung von Lebendzellflecken; Fixierung und Schnitt zur Charakterisierung der Morphologie; Immunfluoreszenzfärbung mit Antikörpern und konfokale Bildgebung ganz, um eine Störung intraluminaler Strukturen zu vermeiden; und Hellfeldbildgebung und mikrooptische Kohärenztomographie zur quantitativen Messung der Ziliarschlagfrequenz und des mukoziliären Transports13. Um die Expansion zu anderen Forschern zu erleichtern, wurden kommerziell erhältliche Reagenzien und Vorräte für die Kultivierung verwendet. Es wurde ein funktioneller Assay entwickelt, der gängige Mikroskoptechniken und speziellere Geräte verwendete. Während das vorliegende Modell entwickelt wurde, um die CFTR-Aktivität zu Studienbeginn oder als Reaktion auf Therapeutika zu bewerten, können die in diesem Protokoll beschriebenen Techniken auf andere Krankheiten angewendet werden, die die Funktion von Epithelzellen, insbesondere den Flüssigkeitstransport von Epithelzellen, betreffen.
Vergleich mit anderen Methoden
Vor kurzem wurde der Nutzen dieses Organoidmodells entwickelt, indem die In-vitro-CFTR-Modulatorreaktionen der Organoide der Patienten mit ihrer klinischen Reaktionkorreliert wurden 11. Insbesondere wird auch gezeigt, dass das vorliegende Modell parallel zu Kurzschlussstromreaktionen, dem aktuellen Goldstandard für die Beurteilung der CFTR-Funktion, bei denselben Patienten war. Der Kurzschlussstrom unterscheidet sich vom Quellassay, da ersterer die CFTR-Funktion über den Ionentransport misst26. Im Gegensatz dazu misst dieser Assay einen eher nachgeschalteten Effekt mit dem Flüssigkeitstransport und liefert zusätzliche Informationen über die Gesamtfunktion von CFTR 27,28,29,30,31,32. Kurzschlussstrommessungen sind nach wie vor eine gängige und zuverlässige Methode zur Bestimmung der CFTR-Chloridkanalaktivität 1,33. Diese elektrophysiologischen Assays erfordern spezielle, teure Ausrüstung, erfordern ein Vielfaches mehr Zellen für jedes experimentelle Replikat als der Organoid-Assay, können nicht einfach automatisiert werden und sind nicht für eine Skalierung für Anwendungen mit höherem Durchsatz geeignet. Ein weiteres Organoidmodell, das von der Darmepithel abgeleitet wurde, hat zusätzliche Vorteile15,16,17,18, wie z.B. eine bessere Replikationsfähigkeit, ist aber weder aus einem Atemwegsgewebe abgeleitet noch universell verfügbar. HNE-Bürsten werden mit kostengünstigen Zytologiebürsten ohne Sedierung und mit minimalem Risiko erhalten. Das Bürsten erfordert keinen Kliniker und kann von ausgebildeten Forschungskoordinatoren und anderen Forschungsmitarbeiterndurchgeführt werden 14. Das HNE-Organoidmodell kann von jedem Labor mit primären Zellkulturfähigkeiten kultiviert werden, und einige der Anwendungen können mit Standard-Mikroskopietechniken durchgeführt werden. Insgesamt bieten diese Vorteile einen zusätzlichen Zugang zu Technologien zur Beurteilung der Epithelfunktion der Atemwege, die sonst einigen Labors möglicherweise nicht zur Verfügung stünden. Darüber hinaus können HNE-Organoide verwendet werden, um andere Krankheitszustände zu untersuchen, die die Atemwege betreffen, wie primäre ziliäre Dyskinesie25 oder Virusinfektion, die Darmorganoide nicht können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript bietet detaillierte Methoden für eine umfassende Live- und fixe Bildgebung der Atemwegsepithelorganoide, die aus der HNE-Pinselbiopsie stammen. Es beschreibt funktionelle Assays, die die CFTR-Aktivität in einer Person bestimmen können. HNEs bieten ein minimalinvasives, primäres Gewebe für eine Vielzahl von Anwendungen. Die hier angebotenen Expansionstechniken können zur Modellierung von Atemwegserkrankungen, einschließlich Organoiden, verwendet werden. Organoide können für präzise therapeutisc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Teilnehmern, die HNE-Bürstenbiopsien zur Entwicklung dieses Protokolls gespendet haben. Wir danken Latona Kersh und den Mitarbeitern der Children’s Research Unit für die Koordination der Freiwilligenrekrutierung und der Probensammlungen. Wir danken Lily Deng, Johnathan Bailey und Stephen Mackay, ehemaligen Auszubildenden in unserem Labor, für die technische Unterstützung. Wir danken Zhong Liu und Rui Zhao für ihre technische Hilfe. Steven M. Rowe, Direktor des CF Research Center an der UAB, stellt Führung und Ressourcen zur Verfügung, ohne die diese Arbeit nicht möglich wäre. Wir danken auch Sarah Guadiana von Biotek für die Unterstützung bei der Instrumentenausbildung, Robert Grabski für die Unterstützung der konfokalen Mikroskopie in der UAB High-Resolution Imaging Facility und Dezhi Wang für die histologische Unterstützung im UAB Histology Core. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) unterstützt. Grant K23HL143167 (an JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (an JSG), das Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 und DK072482 und das CFF University of Alabama at Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)] und das UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
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