زراعة وتصوير المواد العضوية الظهارية الأنفية البشرية
Summary
يتم تقديم بروتوكول مفصل هنا لوصف نموذج عضوي في المختبر من الخلايا الظهارية الأنفية البشرية. ويتضمن البروتوكول خيارات للقياسات التي تتطلب معدات مختبرية قياسية، مع إمكانيات إضافية للمعدات والبرامجيات المتخصصة.
Abstract
يمكن تحقيق العلاج الفردي لمرضى التليف الكيسي (CF) من خلال نموذج مرض في المختبر لفهم نشاط منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) الأساسي واستعادته من مركبات الجزيئات الصغيرة. ركزت مجموعتنا مؤخرا على إنشاء نموذج عضوي متمايز بشكل جيد مشتق مباشرة من الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية (HNE). تعد أنسجة المواد العضوية المجزأة ، وتلطيخ الفلورسنت المناعي الكامل ، والتصوير (باستخدام المجهر البؤري ، والمجهر المناعي الفلوري ، والمجال الساطع) ضرورية لتوصيف المواد العضوية وتأكيد التمايز الظهاري استعدادا للفحوصات الوظيفية. علاوة على ذلك ، تنتج المواد العضوية HNE لومن بأحجام مختلفة ترتبط بنشاط CFTR ، وتميز بين المواد العضوية CF وغير CF. في هذه المخطوطة، يتم وصف منهجية زراعة المواد العضوية ذات الكثافة العالية جدا بالتفصيل، مع التركيز على تقييم التمايز باستخدام طرائق التصوير، بما في ذلك قياس منطقة التجويف الأساسية (وهي طريقة لقياس نشاط CFTR في المواد العضوية التي يمكن لأي مختبر لديه مجهر استخدامها) بالإضافة إلى النهج الآلي المطور للفحص الوظيفي (الذي يتطلب معدات أكثر تخصصا).
Introduction
مقدمة في هذه التقنية
تعد الفحوصات القائمة على الثقافة خارج الجسم الحي أداة تستخدم بشكل متزايد للطب الدقيق ودراسة الفيزيولوجيا المرضية للأمراض. تم استخدام زراعة الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية (HNE) في العديد من الدراسات حول التليف الكيسي 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ، وهو مرض صبغي جسدي متنحي يؤثر على وظيفة الخلايا الظهارية في أعضاء متعددة. توفر زراعة HNE مصدرا متجددا لظهارة مجرى الهواء التي يمكن الحصول عليها بشكل مستقبلي وتلخص الصفات الكهروفسيولوجية والكيميائية الحيوية لاختبار نشاط منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR). يمكن أخذ عينات من خلايا HNE مع الحد الأدنى من الآثار الجانبية14 ، على غرار مسحات الجهاز التنفسي الفيروسية الشائعة. تم نشر عمل بحثي يصف نموذجا لدراسة التليف الكيسي المستمد من خزعات فرشاة HNE مؤخرا11,13. على الرغم من أنها مشابهة للنماذج الأخرى التي تستخدم HNE 2,3 الأولي والأنسجة المعوية 15,16,17,18,19 ، إلا أن التوصيف التفصيلي للتمايز والتصوير لهذا النموذج موصوف هنا للاستخدام في أبحاث التليف الكيسي وللمساعدة في دراسات أمراض الشعب الهوائية الأخرى 13 . النموذج العضوي ليس غير محدود مثل خطوط الخلايا المخلدة ولكن يمكن توسيعه عن طريق إعادة البرمجة الشرطية (باستخدام الخلايا الليفية المغذية المشععة والمعطلة ومثبطات Rho-kinase) إلى حالة أكثر شبها بالخلايا الجذعية20،21،22،23. إن معالجة خزعات فرشاة HNE باستخدام هذه الطريقة تنتج أعدادا كبيرة من الخلايا الظهارية لاستخدامها في تطبيقات متعددة بإنتاجية أعلى مع الاحتفاظ بالقدرة على التمييز بشكل كامل. في حين تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام الخلايا المغذية ، يمكن استخدام منهجيات أخرى من قبل الباحثين الذين يرغبون في تجنب تكنولوجيا الخلايا المغذية14,24.
أهمية هذه التقنية للبيولوجيا الرئوية
تم تكريس دراسة مهمة لفهم كيف أن غياب CFTR المنتظم والفعال في غشاء الخلية للخلايا الظهارية يؤدي إلى خلل وظيفي في الرئتين أو البنكرياس أو الكبد أو الأمعاء أو الأنسجة الأخرى. يؤدي النقل الأيوني الظهاري المختل وظيفيا ، وخاصة الكلوريد والبيكربونات ، إلى انخفاض حجم سوائل البطانة الظهارية وتغيرات في الإفرازات المخاطية ، مما يؤدي إلى الركود المخاطي والانسداد. في أمراض مجرى الهواء الأخرى ، مثل خلل الحركة الهدبي الأولي ، تضعف الحركة الهدبية المتغيرة إزالة الغشاء المخاطي الهدبي وتؤدي إلى الركود المخاطي والانسداد25. لذلك ، تم تطوير نموذج HNE العضوي الحالي لتطبيقات مختلفة ، اعتمادا على التصميم التجريبي للباحث وموارده. وهذا يشمل تصوير الخلايا الحية باستخدام بقع الخلايا الحية. التثبيت والتقسيم لتوصيف المورفولوجيا ؛ تلطيخ التألق المناعي بالأجسام المضادة والتصوير البؤري الكامل لتجنب تعطيل الهياكل داخل اللمعان ؛ والتصوير المقطعي بالحقل الساطع والتصوير المقطعي بالتماسك البصري الدقيق للقياسات الكمية لتردد الضربات الهدبية والنقل المخاطي الهدبي13. ولتسهيل التوسع ليشمل محققين آخرين، استخدمت الكواشف واللوازم المتاحة تجاريا للزراعة. تم تطوير فحص وظيفي يستخدم تقنيات المجهر الشائعة والمعدات الأكثر تخصصا. بشكل عام ، في حين تم تصميم النموذج الحالي لتقييم نشاط CFTR عند خط الأساس أو استجابة للعلاجات ، يمكن تطبيق التقنيات الموصوفة في هذا البروتوكول على الأمراض الأخرى التي تنطوي على وظيفة الخلية الظهارية ، وخاصة نقل سوائل الخلايا الظهارية.
مقارنة مع المنهجيات الأخرى
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير فائدة هذا النموذج العضوي من خلال الربط في المختبر بين استجابات معدل CFTR للعضويات للمرضى مع استجابتهم السريرية11. ومن الجدير بالذكر أنه ثبت أيضا أن النموذج الحالي يوازي استجابات تيار الدائرة القصيرة ، وهو المعيار الذهبي الحالي لتقييم وظيفة CFTR ، في نفس المرضى. يختلف تيار الدائرة القصيرة عن فحص التورم لأن الأول يقيس وظيفة CFTR عبر النقل الأيوني26. في المقابل ، يقيس هذا الفحص تأثيرا أكثر في اتجاه المصب مع نقل السوائل ، مما يوفر معلومات إضافية حول الوظيفة الإجمالية ل CFTR27،28،29،30،31،32. ظلت قياسات تيار الدائرة القصيرة طريقة شائعة وموثوقة لتحديد نشاط قناة كلوريد CFTR 1,33. تتطلب هذه الفيزيولوجيا الكهربية معدات متخصصة ومكلفة ، وتتطلب خلايا أكثر بعدة مرات لكل نسخة تجريبية من الفحص العضوي ، ولا يمكن أتمتتها بسهولة ، وليست قابلة للتوسع لتطبيقات الإنتاجية الأعلى. نموذج عضوي آخر مشتق من ظهارة الأمعاء له مزايا إضافية 15،16،17،18 ، مثل قدرة تكرارية أكثر ممتازة ، ولكنه غير مشتق من أنسجة مجرى الهواء ولا هو متاح عالميا. يتم الحصول على فرش HNE باستخدام فرش خلوية غير مكلفة دون الحاجة إلى التخدير وبأقل قدر من المخاطر. لا يتطلب الحصول على التنظيف بالفرشاة طبيبا سريريا ويمكن القيام به من قبل منسقي الأبحاث المدربين وغيرهم من موظفي الأبحاث14. يمكن استزراع نموذج HNE العضوي من قبل أي مختبر لديه قدرات زراعة الخلايا الأولية ، ويمكن إجراء بعض التطبيقات باستخدام تقنيات الفحص المجهري القياسية. وإجمالا، توفر هذه المزايا وصولا إضافيا إلى التكنولوجيا اللازمة لتقييم الوظيفة الظهارية لمجرى الهواء التي قد لا تكون متاحة لبعض المختبرات. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام عضويات HNE لدراسة الحالات المرضية الأخرى التي تؤثر على مجرى الهواء ، مثل خلل الحركة الهدبي الأولي25 أو العدوى الفيروسية ، والتي لا تستطيع المواد العضوية المعوية القيام بها.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر هذه المخطوطة منهجيات مفصلة للتصوير الحي والثابت الشامل للعضويات الظهارية في مجرى الهواء المستمدة من خزعة فرشاة HNE. وهو يصف المقايسات الوظيفية التي يمكن أن تحدد نشاط CFTR في الفرد. توفر HNEs نسيجا أوليا ضئيل التوغل لمجموعة متنوعة من التطبيقات. يمكن استخدام تقنيات التوسع المقدمة هنا لنمذج?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر بامتنان مساهمات جميع المشاركين الذين تبرعوا بخزعات فرشاة HNE لتطوير هذا البروتوكول. نشكر لاتونا كيرش وموظفي وحدة أبحاث الأطفال على تنسيق توظيف المتطوعين في الدراسة وجمع العينات. ونشكر ليلي دينغ وجوناثان بيلي وستيفن ماكاي، المتدربين السابقين في مختبرنا، على المساعدة التقنية. نشكر تشونغ ليو وروي جاو على مساعدتهما التقنية. يوفر ستيفن م. رو ، مدير مركز أبحاث CF في UAB ، القيادة والموارد ، والتي بدونها لن يكون هذا العمل ممكنا. كما نود أن نشكر سارة غواديانا في Biotek على المساعدة في التدريب على الأدوات ، وروبرت غرابسكي على المساعدة في الفحص المجهري البؤري في مرفق التصوير عالي الدقة التابع للبنك العربي المتحد ، وديزي وانغ على المساعدة النسيجية في مركز علم الأنسجة في UAB. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH). منحة K23HL143167 (إلى JSG) ، مؤسسة التليف الكيسي (CFF) منحة GUIMBE18A0-Q (إلى JSG) ، مركز غريغوري فليمنغ جيمس للتليف الكيسي [منح المعاهد الوطنية للصحة R35HL135816 و DK072482 و CFF جامعة ألاباما في برمنغهام (UAB) برنامج البحث والتطوير (Rowe19RO)] ، ومركز UAB للعلوم السريرية والانتقالية (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. . CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. . Lionheart FX Live Cell Imager Operator’s Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
