Kultur og billeddannelse af humane nasale epitelorganoider
Summary
En detaljeret protokol præsenteres her for at beskrive en in vitro-organoidmodel fra humane nasale epitelceller. Protokollen har muligheder for målinger, der kræver standard laboratorieudstyr, med yderligere muligheder for specialudstyr og software.
Abstract
Individualiseret terapi til cystisk fibrose (CF) patienter kan opnås med en in vitro sygdomsmodel for at forstå baseline Cystisk Fibrose Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) aktivitet og restaurering fra små molekyleforbindelser. Vores gruppe fokuserede for nylig på at etablere en veldifferentieret organoidmodel direkte afledt af primære humane nasale epitelceller (HNE). Histologi af sektionerede organoider, helmonteret immunofluorescerende farvning og billeddannelse (ved hjælp af konfokal mikroskopi, immunofluorescerende mikroskopi og lyst felt) er afgørende for at karakterisere organoider og bekræfte epiteldifferentiering som forberedelse til funktionelle assays. Desuden producerer HNE-organoider lumen af varierende størrelse, der korrelerer med CFTR-aktivitet, idet der skelnes mellem CF- og ikke-CF-organoider. I dette manuskript beskrives metoden til dyrkning af HNE-organoider detaljeret med fokus på vurdering af differentiering ved hjælp af billeddannelsesmetoderne, herunder måling af baseline lumenområde (en metode til CFTR-aktivitetsmåling i organoider, som ethvert laboratorium med et mikroskop kan anvende) samt den udviklede automatiserede tilgang til et funktionelt assay (som kræver mere specialiseret udstyr).
Introduction
Introduktion til teknikken
Ex vivo kulturbaserede assays er et stadig mere anvendt værktøj til præcisionsmedicin og studiet af sygdomspatofysiologi. Primær human nasal epitel (HNE) cellekultur er blevet anvendt i adskillige undersøgelser af cystisk fibrose 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , en autosomal recessiv sygdom, der påvirker epitelcellefunktionen i flere organer. HNE-kultur giver en vedvarende kilde til luftvejsepitel, der kan opnås fremadrettet og rekapitulerer elektrofysiologiske og biokemiske kvaliteter for at teste cystisk fibrose transmembrane konduktansregulator (CFTR) aktivitet. HNE-celler kan prøveudtages med minimale bivirkninger14, svarende til almindelige virale respiratoriske vatpinde. Forskningsarbejde, der beskriver en model for cystisk fibrose undersøgelse afledt af HNE børstebiopsier er for nylig blevet offentliggjort11,13. I lighed med andre modeller, der anvender primær HNE 2,3 og tarmvæv 15,16,17,18,19, beskrives detaljeret karakterisering af differentieringen og billeddannelsen af denne model her til brug i CF-forskning og til støtte i undersøgelser af andre luftvejssygdomme 13 . Organoidmodellen er ikke ubegrænset som udødeliggjorte cellelinjer, men kan udvides ved betinget omprogrammering (ved hjælp af bestrålede og inaktiverede feederfibroblaster og Rho-kinasehæmmere) til en mere stamcellelignende tilstand 20,21,22,23. Behandlingen af HNE-børstebiopsier ved hjælp af denne metode giver et stort antal epitelceller til brug i flere applikationer ved højere gennemstrømning, samtidig med at evnen til at differentiere fuldt ud bevares. Mens denne protokol blev udviklet ved hjælp af feederceller, kan andre metoder anvendes af efterforskere, der ønsker at undgå feedercelleteknologi14,24.
Betydningen af teknikken for lungebiologi
En betydelig undersøgelse er blevet afsat til at forstå, hvordan fraværet af regelmæssig, fungerende CFTR i cellemembranen i epitelceller resulterer i dysfunktion i lungerne, bugspytkirtlen, leveren, tarmen eller andre væv. Dysfunktionel epiteliontransport, især for chlorid og bicarbonat, resulterer i et nedsat volumen af epitelforingsvæskerne og ændringer i slimhindesekretioner, hvilket fører til slimhindestasis og obstruktion. I andre luftvejssygdomme, såsom primær ciliær dyskinesi, forringer ændret ciliær bevægelse mucociliær clearance og fører til slimhindestasis og obstruktion25. Derfor er den nuværende HNE-organoidmodel udviklet til forskellige anvendelser afhængigt af investigatorens eksperimentelle design og ressourcer. Dette omfatter levende cellebilleddannelse ved hjælp af levende cellepletter; fiksering og sektionering for at karakterisere morfologien; immunofluorescensfarvning med antistoffer og helmonteret konfokal billeddannelse for at undgå at forstyrre intraluminale strukturer; og lysfeltsbilleddannelse og mikrooptisk kohærenstomografi til kvantitative målinger af ciliary beat-frekvens og mucociliær transport13. For at lette udvidelsen til andre efterforskere blev kommercielt tilgængelige reagenser og forsyninger brugt til dyrkning. Der blev udviklet et funktionelt assay, der brugte almindelige mikroskopteknikker og mere specialiseret udstyr. Samlet set, mens den nuværende model blev designet til at vurdere CFTR-aktivitet ved baseline eller som reaktion på terapi, kan de teknikker, der er beskrevet i denne protokol, anvendes på andre sygdomme, der involverer epitelcellefunktion, især epitelcellevæsketransport.
Sammenligning med andre metoder
For nylig blev nytten af denne organoidmodel udviklet ved at korrelere in vitro CFTR-modulatorresponser fra patienters organoider med deres kliniske respons11. Det er navnlig også påvist, at den nuværende model parallelt med kortslutningsstrømresponser, den nuværende guldstandard for vurdering af CFTR-funktion, hos de samme patienter. Kortslutningsstrøm adskiller sig fra hævelsesassayet, fordi førstnævnte måler CFTR-funktion via iontransport26. I modsætning hertil måler dette assay en mere nedstrøms effekt med væsketransport, hvilket giver yderligere oplysninger om den samlede funktion af CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortslutningsstrømmålinger har fortsat været en almindelig og pålidelig metode til bestemmelse af CFTR-chloridkanalaktivitet 1,33. Disse elektrofysiologiske assays kræver specialiseret, dyrt udstyr, kræver mange gange flere celler til hver eksperimentel replikat end organoidassayet, kan ikke let automatiseres og er ikke modtagelige for opskalering til applikationer med højere gennemstrømning. En anden organoidmodel afledt af tarmepitel har yderligere fordele 15,16,17,18, såsom mere fremragende replikativ kapacitet, men er hverken afledt af et luftvejsvæv eller er universelt tilgængeligt. HNE børstninger opnås med billige cytologibørster uden behov for sedation og med minimal risiko. At få børstningen kræver ikke en kliniker og kan udføres af uddannede forskningskoordinatorer og andet forskningspersonale14. HNE-organoidmodellen kan dyrkes af ethvert laboratorium med primærcellekulturkapacitet, og nogle af applikationerne kan udføres med standardmikroskopiteknikker. Alt i alt giver disse fordele yderligere adgang til teknologi til vurdering af luftvejsepitelfunktion, som ellers ville være utilgængelig for nogle laboratorier. Desuden kan HNE-organoider bruges til at studere andre sygdomstilstande, der påvirker luftvejene, såsom primær ciliær dyskinesi25 eller virusinfektion, som tarmorganoider ikke kan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette manuskript giver detaljerede metoder til omfattende levende og fast billeddannelse af luftvejsepitelorganoiderne afledt af HNE børstebiopsi. Det beskriver funktionelle assays, der kan bestemme CFTR-aktivitet hos et individ. HVE’er giver et minimalt invasivt, primært væv til en række applikationer. De ekspansionsteknikker, der tilbydes her, kan bruges til modellering af luftvejssygdomme, herunder organoider. Organoider kan bruges til præcisionsterapeutiske tilgange og til at overvåge stabiliteten af gen- eller…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender taknemmeligt bidragene fra alle de deltagere, der donerede HNE børstebiopsier til at udvikle denne protokol. Vi takker Latona Kersh og Children’s Research Unit personale for at koordinere rekruttering af frivillige studier og prøvesamlinger. Vi takker Lily Deng, Johnathan Bailey og Stephen Mackay, tidligere praktikanter i vores laboratorium, for teknisk assistance. Vi takker Zhong Liu og Rui Zhao for deres tekniske hjælp. Steven M. Rowe, direktør for CF Research Center ved UAB, leverer lederskab og ressourcer, uden hvilke dette arbejde ikke ville være muligt. Vi vil også gerne takke Sarah Guadiana hos Biotek for hjælp med instrumenttræning, Robert Grabski for konfokal mikroskopi assistance på UAB High-Resolution Imaging Facility og Dezhi Wang for histologisk bistand på UAB Histology Core. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (til JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (til JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 og DK072482 og CFF University of Alabama i Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], og UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. . CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. . Lionheart FX Live Cell Imager Operator’s Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
