JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Kultur og bildebehandling av humane neseepitelorganoider

Published: December 17, 2021
doi:
10.3791/63064
, , ,
1Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Research Center,University of Alabama at Birmingham (UAB), 2Department of Pediatrics, Division of Pulmonary and Sleep Medicine,UAB

Summary

En detaljert protokoll presenteres her for å beskrive en in vitro organoid modell fra menneskelige nese epitelceller. Protokollen har muligheter for målinger som krever standard laboratorieutstyr, med tilleggsmuligheter for spesialutstyr og programvare.

Abstract

Individualisert behandling for cystisk fibrose (CF) pasienter kan oppnås med en in vitro sykdomsmodell for å forstå baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) aktivitet og restaurering fra små molekylforbindelser. Vår gruppe fokuserte nylig på å etablere en godt differensiert organoidmodell direkte avledet fra primære humane neseepitelceller (HNE). Histologi av seksjonerte organoider, helmontert immunfluorescerende farging og avbildning (ved hjelp av konfomisk mikroskopi, immunfluorescerende mikroskopi og lyst felt) er avgjørende for å karakterisere organoider og bekrefte epiteldifferensiering som forberedelse til funksjonelle analyser. Videre produserer HNE organoider lumen av varierende størrelse som korrelerer med CFTR-aktivitet, som skiller mellom CF og ikke-CF organoider. I dette manuskriptet er metodikken for å dyrke HNE-organoider beskrevet i detalj, med fokus på vurdering av differensiering ved hjelp av avbildningsmodaliteter, inkludert måling av baseline lumenområde (en metode for CFTR-aktivitetsmåling i organoider som ethvert laboratorium med et mikroskop kan bruke) samt den utviklede automatiserte tilnærmingen til en funksjonell analyse (som krever mer spesialisert utstyr).

Introduction

Introduksjon til teknikken
Ex vivo kulturbaserte analyser er et stadig mer brukt verktøy for presisjonsmedisin og studiet av sykdom patofysiologi. Primær human nasal epitel (HNE) cellekultur har blitt brukt i en rekke studier av cystisk fibrose 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , en autosomal recessiv sykdom som påvirker epitelcellefunksjonen i flere organer. HNE-kulturen gir en fornybar kilde til luftveisepilesi som kan oppnås prospektivt og rekapitulerer elektrofysiologiske og biokjemiske egenskaper for å teste Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) aktivitet. HNE-celler kan prøves med minimale bivirkninger14, som ligner vanlige virale respiratoriske vattpinner. Forskningsarbeid som beskriver en modell for cystisk fibrosestudie avledet fra HNE børstebiopsier har nylig blitt publisert11,13. Mens ligner på andre modeller som bruker primær HNE 2,3 og tarmvev 15,16,17,18,19, er detaljert karakterisering av differensiering og avbildning av denne modellen beskrevet her for bruk i CF-forskning og for å hjelpe til med studier av andre luftveissykdommer13 . Den organoide modellen er ikke ubegrenset som udødelige cellelinjer, men kan utvides ved betinget omprogrammering (ved hjelp av bestrålede og inaktiverte materfibroblaster og Rho-kinase-hemmere) til en mer stamcellelignende tilstand 20,21,22,23. Behandlingen av HNE børstebiopsier ved hjelp av denne metoden gir et stort antall epitelceller for bruk i flere applikasjoner med høyere gjennomstrømning, samtidig som de beholder evnen til å skille seg helt ut. Mens denne protokollen ble utviklet ved hjelp av materceller, kan andre metoder brukes av etterforskere som ønsker å unngå matercelleteknologi14,24.

Teknikkens betydning for lungebiologien
En betydelig studie har vært viet til å forstå hvordan fraværet av vanlig, fungerende CFTR i cellemembranen til epitelceller resulterer i dysfunksjon i lungene, bukspyttkjertelen, leveren, tarmen eller andre vev. Dysfunksjonell epitelial iontransport, spesielt klorid og bikarbonat, resulterer i et redusert volum av epitelforingsvæsker og endringer i slimete sekreter, noe som fører til slimete stasis og obstruksjon. Ved andre luftveissykdommer, som primær ciliary dyskinesi, svekker endret ciliary bevegelse mucociliary clearance og fører til slimete stasis og obstruksjon25. Derfor er den nåværende HNE organoid-modellen utviklet for ulike bruksområder, avhengig av undersøkerens eksperimentelle design og ressurser. Dette inkluderer levende cellebilder ved hjelp av levende celleflekker; fiksering og seksjonering for å karakterisere morfologien; immunfluorescensfarging med antistoffer og helmontert konføling for å unngå å forstyrre intraluminale strukturer; og lysfeltavbildning og mikrooptisk koherenstomografi for kvantitative målinger av ciliary beatfrekvens og mucociliary transport13. For å lette ekspansjonen til andre etterforskere ble kommersielt tilgjengelige reagenser og forsyninger brukt til dyrking. En funksjonell analyse ble utviklet som brukte vanlige mikroskopteknikker og mer spesialisert utstyr. Totalt sett, mens den nåværende modellen ble designet for å vurdere CFTR-aktivitet ved baseline eller som svar på terapeutiske behandlinger, kan teknikkene beskrevet i denne protokollen brukes på andre sykdommer som involverer epitelcellefunksjon, spesielt epitelcellevæsketransport.

Sammenligning med andre metoder
Nylig ble nytten av denne organoidmodellen utviklet ved å korrelere in vitro CFTR-modulatorresponser fra pasientens organoider med deres kliniske respons11. Spesielt er det også demonstrert at den nåværende modellen parallelt kortslutningsstrømresponser, den nåværende gullstandarden for å vurdere CFTR-funksjon, hos de samme pasientene. Kortslutningsstrømmen skiller seg fra hevelsesanalysen fordi førstnevnte måler CFTR-funksjon via iontransport26. Derimot måler denne analysen en mer nedstrøms effekt med væsketransport, og gir ytterligere informasjon om den generelle funksjonen til CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortslutningsstrømmålinger har fortsatt å være en vanlig og pålitelig metode for å bestemme CFTR-kloridkanalaktivitet 1,33. Disse elektrofysiologiske analysene krever spesialisert, dyrt utstyr, krever mange ganger flere celler for hver eksperimentelle replikering enn den organoide analysen, kan ikke enkelt automatiseres, og er ikke egnet til å skalere opp for høyere gjennomstrømningsapplikasjoner. En annen organoid modell avledet fra intestinal epithelia har ytterligere fordeler 15,16,17,18, for eksempel mer utmerket replikeringsevne, men er verken avledet fra et luftveisvev eller er universelt tilgjengelig. HNE-børsting oppnås med billige cytologibørster uten behov for sedasjon og med minimal risiko. Å få pusset krever ikke en kliniker og kan utføres av utdannede forskningskoordinatorer og andre forskningspersonell14. HNE organoid-modellen kan dyrkes av ethvert laboratorium med primære cellekulturfunksjoner, og noen av applikasjonene kan utføres med standard mikroskopiteknikker. Til sammen gir disse fordelene ytterligere tilgang til teknologi for å vurdere epitelfunksjon for luftveier som ellers kunne være utilgjengelig for noen laboratorier. Videre kan HNE organoider brukes til å studere andre sykdomstilstander som påvirker luftveiene, for eksempel primær ciliary dyskinesi25 eller virusinfeksjon, som intestinale organoider ikke kan.

Protocol

HNE-prøver ble samlet inn på Children’s of Alabama hospital. Alle prosedyrer og metoder beskrevet her er godkjent av IRB University of Alabama i Birmingham (UAB IRB #151030001). For å lette utvidelsen og forbedre funksjonen til humane neseepitelceller (HNEer), er de nåværende dyrkingsmetodene tilpasset fra den velkjente luftvæskegrensesnitt (ALI) kulturmetoden28,34. HNE ble opprinnelig samlet inn av børstebiopsi som tidligere beskrevet</s…

Representative Results

HNEs ekspansjon er avgjørende for en blomstrende organoidkultur. HNEer fra en vellykket utvalgssamling bør utvides til over 70% samløp rundt 10 dager. Et eksempel på vellykkede og mislykkede prøver vises i henholdsvis figur 1A og figur 1B. Cellene må kastes hvis de ikke kan nå 70% samløp med 14 dager etter samkultur med bestrålede 3T3 celler. Eventuelle forurensede celler skal umiddelbart kastes hvis de ikke kan reddes med ytterligere a…

Discussion

Dette manuskriptet gir detaljerte metoder for omfattende levende og fast avbildning av luftveis epitelorganoider avledet fra HNE børstebiopsi. Den beskriver funksjonelle analyser som kan bestemme CFTR-aktivitet hos en person. HNEer gir et minimalt invasivt, primært vev for en rekke bruksområder. Ekspansjonsteknikkene som tilbys her kan brukes til modellering av luftveissykdom, inkludert organoider. Organoider kan brukes til presisjonsterapeutiske tilnærminger og for å overvåke stabiliteten til gen- eller mRNA-baser…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi anerkjenner takknemlig bidragene fra alle deltakerne som donerte HNE børstebiopsier for å utvikle denne protokollen. Vi takker Latona Kersh og children’s Research Unit ansatte for koordinering av studiens frivillige rekruttering og prøvesamlinger. Vi takker Lily Deng, Johnathan Bailey og Stephen Mackay, tidligere praktikanter i laboratoriet vårt, for teknisk assistanse. Vi takker Zhong Liu og Rui Zhao for deres tekniske hjelp. Steven M. Rowe, direktør for CF Research Center ved UAB, gir lederskap og ressurser, uten hvilket dette arbeidet ikke ville være mulig. Vi vil også takke Sarah Guadiana i Biotek for hjelp med instrumentopplæring, Robert Grabski for konfiskert mikroskopihjelp ved UAB High-Resolution Imaging Facility, og Dezhi Wang for histologisk hjelp ved UAB Histology Core. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (til JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (til JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 og DK072482 og CFF University of Alabama ved Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)], og UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).

Materials

Nasal brush Medical Packaging CYB1 CYB-1 Length: 8 inches, width approximately 7 mm
Large-Orifice Pipette Tips ThermoFisher Scientific 02-707-141 Large bore pipette tips
Accutase ThermoFisher Scientific A1110501 Cell detachment solution
0.05% trypsin -EDTA Gibco 25300-054
Trypsin inhibitor from soybean Sigma T6522 Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS
Matrigel matrix Corning 356255 Extracellular matrix (EM)
µ-Slide Angiogenesis Ibidi 81506 15-well slide
24-Well Transwell Corning 7200154 Culture insert
Chambered Coverglass ThermoFisher Scientific 155409 8-well glass-bottom chamber slides
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive ThermoFisher Scientific 354240 Cell adhesive
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 50980487
Triton X-100 Alfa Aesar A16046
BSA ThermoFisher Scientific BP1600-100
NucBlue ThermoFisher Scientific R37605 DAPI
Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) Nikon Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope
Nikon A1R-HD25 Nikon Confocal microscope
NIS Elements- Basic Research Nikon manual imaging analysis software
Histogel ThermoFisher Scientific HG-4000-012
Disposable Base Molds ThermoFisher Scientific 41-740
Lionheart FX BioTek BTLFX Automated image system
Lionheart Cover BioTek BT1450009 Environmental Control Lid
Humidity Chamber BioTek BT1450006 Stage insert (environmental chamber)
Gas Controller for CO2 and O2 BioTek BT1210013 Gas controller
Microplate/Slide Stage Insert BioTek BT1450527 Slide holder
Gen5 Imaging Prime Software BioTek BTGEN5IPRIM Automated imaging analysis software
4x Phase Contrast Objective BioTek BT1320515
10x Phase Contrast Objective BioTek BT1320516
LED Cube BioTek BT1225007
Filter Cube (DAPI) BioTek BT1225100 DAPI
CFTRinh-172 Selleck Chemicals S7139
Forskolin Sigma F6886
IBMX Sigma I5879
Expansion Media
DMEM ThermoFisher Scientific 11965
F12 Nutrient mix ThermoFisher Scientific 11765
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Scientific  16140-071
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher Scientific  15-140-122
Cholera Toxin Sigma  C8052
Epidermal Growth Factor (EGF) ThermoFisher Scientific  PHG0314
Hydrocortisone (HC) Sigma  H0888
Insulin Sigma  I9278
Adenine Sigma  A2786
Y-27632 Stemgent  04-0012-02
Antibiotic Media
Ceftazidime Alfa Aesar  J66460-03
Tobramycin Alfa Aesar  J67340
Vancomycin Alfa Aesar  J67251
Amphotericin B Sigma  A2942
Differentiation Media
DMEM/F-12 (1:1) ThermoFisher Scientific  11330-32
Ultroser-G Pall  15950-017
Fetal Clone II Hyclone  SH30066.03
Bovine Brain Extract Lonza  CC-4098
Insulin Sigma  I-9278
Hydrocortisone Sigma  H-0888
Triiodothyronine Sigma  T-6397
Transferrin Sigma  T-0665
Ethanolamine Sigma  E-0135
Epinephrine Sigma E-4250
O-Phosphorylethanolamine Sigma P-0503
Retinoic Acid Sigma R-2625
Primary antibodies
Human CFTR antibody R&D Systems MAB1660 Dilution: 100x
ZO-1 antibody Thermo Fisher MA3-39100-A647 Dilution: 1000x
Anti-MUC5B antibody Sigma HPA008246 Dilution: 100x
Anti-acetylated tubulin Sigma T7451 Dilution: 100x
Anti-beta IV Tubulin antibody Abcam Ab11315 Dilution: 100x
Secondary antibodies
Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 Invitrogen A21202 Dilution: 2000x
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 Invitrogen A21207 Dilution: 2000x
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
  2. Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
  3. Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
  4. Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
  5. Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
  6. Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
  7. Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
  8. de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
  9. Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
  10. Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
  11. Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
  12. Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
  13. Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
  14. Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
  15. Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
  16. Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
  17. Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
  18. Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
  19. Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
  20. Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
  21. Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
  22. Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
  23. Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
  24. Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
  25. Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
  26. Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
  27. Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
  28. Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
  29. Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
  30. Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
  31. Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
  32. Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
  33. McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
  34. Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
  35. Corning Inc. . CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).
  36. Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
  37. Biotek Instruments, Incorporated. . Lionheart FX Live Cell Imager Operator’s Manual. , (2016).
  38. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  39. Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
  40. McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
  41. Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).

Tags

Nasal Epithelial OrganoidsCystic FibrosisCFTR ActivityEpithelial Ion TransportEpithelial Cell Fluid TransportPrimary Ciliary DyskinesiaCell DissociationCell Expansion3T3 FibroblastsCell CultureCell Imaging
check_url/63064?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Liu, Z., Anderson, J. D., Natt, J., Guimbellot, J. S. Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids. J. Vis. Exp. (178), e63064, doi:10.3791/63064 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image