Kultur och avbildning av humana nasala epitelorganoider
Summary
Ett detaljerat protokoll presenteras här för att beskriva en in vitro-organoidmodell från humana nasala epitelceller. Protokollet har alternativ för mätningar som kräver standard laboratorieutrustning, med ytterligare möjligheter till specialutrustning och programvara.
Abstract
Individualiserad behandling för patienter med cystisk fibros (CF) kan uppnås med en in vitro-sjukdomsmodell för att förstå baseline Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) aktivitet och återställande från småmolekylära föreningar. Vår grupp fokuserade nyligen på att etablera en väl differentierad organoidmodell direkt härledd från primära humana nasala epitelceller (HNE). Histologi av sektionerade organoider, helmonterad immunofluorescerande färgning och avbildning (med användning av konfokalmikroskopi, immunofluorescerande mikroskopi och ljusfält) är väsentliga för att karakterisera organoider och bekräfta epiteldifferentiering som förberedelse för funktionella analyser. Dessutom producerar HNE-organoider lumen av varierande storlek som korrelerar med CFTR-aktivitet, vilket skiljer mellan CF- och icke-CF-organoider. I detta manuskript beskrivs metoden för odling av HNE-organoider i detalj, med fokus på bedömningen av differentiering med hjälp av bildmetoderna, inklusive mätning av baslinjens lumenområde (en metod för CFTR-aktivitetsmätning i organoider som alla laboratorier med mikroskop kan använda) samt det utvecklade automatiserade tillvägagångssättet för en funktionell analys (som kräver mer specialiserad utrustning).
Introduction
Introduktion till tekniken
Ex vivo kulturbaserade analyser är ett alltmer använt verktyg för precisionsmedicin och studier av sjukdomsattofysiologi. Primär human nasal epitelial (HNE) cellodling har använts i många studier av cystisk fibros 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 , en autosomal recessiv sjukdom som påverkar epitelcellsfunktionen i flera organ. HNE-kultur ger en förnybar källa till luftvägsepitel som kan erhållas prospektivt och rekapitulerar elektrofysiologiska och biokemiska egenskaper för att testa Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) aktivitet. HNE-celler kan provtas med minimala biverkningar14, liknande vanliga virala andningspinnar. Forskningsarbete som beskriver en modell för cystisk fibrosstudie härledd från HNE-borstbiopsier har nyligen publicerats 11,13. I likhet med andra modeller som använder primär HNE 2,3 och tarmvävnad 15,16,17,18,19 beskrivs här detaljerad karakterisering av differentieringen och avbildningen av denna modell för användning i CF-forskning och för att hjälpa till i studier av andra luftvägssjukdomar 13 . Organoidmodellen är inte obegränsad som odödliga cellinjer utan kan utökas genom villkorlig omprogrammering (med användning av bestrålade och inaktiverade matarfibroblaster och Rho-kinashämmare) till ett mer stamcellsliknande tillstånd 20,21,22,23. Bearbetningen av HNE-borstbiopsier med denna metod ger ett stort antal epitelceller för användning i flera applikationer med högre genomströmning samtidigt som förmågan att differentiera sig helt bibehålls. Medan detta protokoll utvecklades med hjälp av matarceller kan andra metoder användas av utredare som vill undvika matarcellsteknik14,24.
Teknikens betydelse för lungbiologi
En betydande studie har ägnats åt att förstå hur frånvaron av regelbunden, fungerande CFTR i cellmembranet i epitelceller resulterar i dysfunktion i lungorna, bukspottkörteln, levern, tarmen eller andra vävnader. Dysfunktionell epitelial jontransport, särskilt den för klorid och bikarbonat, resulterar i en minskad volym av epitelfodervätskorna och förändringar i slemhinnor, vilket leder till slemhinnor och obstruktion. Vid andra luftvägssjukdomar, såsom primär ciliär dyskinesi, försämrar förändrad ciliär rörelse mukociliär clearance och leder till slemhinnor och obstruktion25. Därför har den nuvarande HNE-organoidmodellen utvecklats för olika tillämpningar, beroende på prövarens experimentella design och resurser. Detta inkluderar live-cell-avbildning med hjälp av levande cellfläckar; fixering och sektionering för att karakterisera morfologin; immunofluorescensfärgning med antikroppar och helmonterad konfokalavbildning för att undvika att störa intraluminala strukturer; och ljusfältsavbildning och mikrooptisk koherenstomografi för kvantitativa mätningar av ciliär slagfrekvens och mukociliär transport13. För att underlätta expansionen till andra utredare användes kommersiellt tillgängliga reagenser och förnödenheter för odling. En funktionell analys utvecklades som använde vanliga mikroskoptekniker och mer specialiserad utrustning. Sammantaget, medan den nuvarande modellen utformades för att bedöma CFTR-aktivitet vid baslinjen eller som svar på terapier, kan de tekniker som beskrivs i detta protokoll tillämpas på andra sjukdomar som involverar epitelcellsfunktion, särskilt epitelcellsvätsketransport.
Jämförelse med andra metoder
Nyligen utvecklades nyttan av denna organoidmodell genom att korrelera CFTR-modulatorsvar in vitro hos patienternas organoider med deras kliniska svar11. I synnerhet visas det också att den nuvarande modellen parallella kortslutningsströmsvar, den nuvarande guldstandarden för bedömning av CFTR-funktionen, hos samma patienter. Kortslutningsström skiljer sig från svullnadsanalysen eftersom den förra mäter CFTR-funktionen via jontransport26. Däremot mäter denna analys en mer nedströms effekt med vätsketransport, vilket ger ytterligare information om den övergripande funktionen av CFTR 27,28,29,30,31,32. Kortslutningsströmmätningar har fortsatt att vara en vanlig och tillförlitlig metod för att bestämma CFTR-kloridkanalaktivitet 1,33. Dessa elektrofysiologiska analyser kräver specialiserad, dyr utrustning, kräver många gånger fler celler för varje experimentell replikat än organoidanalysen, kan inte enkelt automatiseras och är inte mottagliga för uppskalning för applikationer med högre genomströmning. En annan organoidmodell härledd från tarmepitel har ytterligare fördelar 15,16,17,18, såsom mer utmärkt replikativ förmåga, men härrör varken från en luftvägsvävnad eller är allmänt tillgänglig. HNE-borstningar erhålls med billiga cytologiborstar utan behov av sedering och med minimal risk. Att få borstningen kräver ingen kliniker och kan utföras av utbildade forskningskoordinatorer och annan forskningspersonal14. HNE-organoidmodellen kan odlas av alla laboratorier med primär cellodlingskapacitet, och några av applikationerna kan utföras med standardmikroskopitekniker. Sammantaget ger dessa fördelar ytterligare tillgång till teknik för att bedöma luftvägsepitelfunktionen som annars inte skulle vara tillgänglig för vissa laboratorier. Vidare kan HNE-organoider användas för att studera andra sjukdomstillstånd som påverkar luftvägarna, såsom primär ciliär dyskinesi25 eller virusinfektion, vilket tarmorganoider inte kan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta manuskript ger detaljerade metoder för omfattande levande och fast avbildning av luftvägsepitelorganoiderna härledda från HNE-borstbiopsi. Den beskriver funktionella analyser som kan bestämma CFTR-aktivitet hos en individ. HRE ger en minimalt invasiv, primär vävnad för en mängd olika applikationer. Expansionsteknikerna som erbjuds här kan användas för modellering av luftvägssjukdomar, inklusive organoider. Organoider kan användas för precisionsterapeutiska metoder och för att övervaka stabiliteten …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi erkänner tacksamt bidragen från alla deltagare som donerade HNE-borstbiopsier för att utveckla detta protokoll. Vi tackar Latona Kersh och children’s Research Unit personal för att samordna rekrytering av studievolontärer och provsamlingar. Vi tackar Lily Deng, Johnathan Bailey och Stephen Mackay, tidigare praktikanter i vårt laboratorium, för teknisk hjälp. Vi tackar Zhong Liu och Rui Zhao för deras tekniska hjälp. Steven M. Rowe, chef för CF Research Center vid UAB, tillhandahåller ledarskap och resurser, utan vilka detta arbete inte skulle vara möjligt. Vi vill också tacka Sarah Guadiana på Biotek för hjälp med instrumentutbildning, Robert Grabski för konfokalmikroskopihjälp vid UAB High-Resolution Imaging Facility och Dezhi Wang för histologisk hjälp vid UAB Histology Core. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH.) Grant K23HL143167 (till JSG), Cystic Fibrosis Foundation (CFF) Grant GUIMBE18A0-Q (till JSG), Gregory Fleming James Cystic Fibrosis Center [NIH Grants R35HL135816 och DK072482 och CFF University of Alabama i Birmingham (UAB) Research and Development Program (Rowe19RO)] och UAB Center for Clinical and Translational Science (NIH Grant UL1TR001417).
Materials
| Nasal brush | Medical Packaging CYB1 | CYB-1 | Length: 8 inches, width approximately 7 mm |
| Large-Orifice Pipette Tips | ThermoFisher Scientific | 02-707-141 | Large bore pipette tips |
| Accutase | ThermoFisher Scientific | A1110501 | Cell detachment solution |
| 0.05% trypsin -EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | Working solution: 1mg/mL in 1XDPBS |
| Matrigel matrix | Corning | 356255 | Extracellular matrix (EM) |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81506 | 15-well slide |
| 24-Well Transwell | Corning | 7200154 | Culture insert |
| Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155409 | 8-well glass-bottom chamber slides |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive | ThermoFisher Scientific | 354240 | Cell adhesive |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50980487 | |
| Triton X-100 | Alfa Aesar | A16046 | |
| BSA | ThermoFisher Scientific | BP1600-100 | |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | DAPI |
| Eclipse Ts2-FL (Inverted Routine Microscope) | Nikon | Inverted epi-fluorescence microscope or bright-field microscope | |
| Nikon A1R-HD25 | Nikon | Confocal microscope | |
| NIS Elements- Basic Research | Nikon | manual imaging analysis software | |
| Histogel | ThermoFisher Scientific | HG-4000-012 | |
| Disposable Base Molds | ThermoFisher Scientific | 41-740 | |
| Lionheart FX | BioTek | BTLFX | Automated image system |
| Lionheart Cover | BioTek | BT1450009 | Environmental Control Lid |
| Humidity Chamber | BioTek | BT1450006 | Stage insert (environmental chamber) |
| Gas Controller for CO2 and O2 | BioTek | BT1210013 | Gas controller |
| Microplate/Slide Stage Insert | BioTek | BT1450527 | Slide holder |
| Gen5 Imaging Prime Software | BioTek | BTGEN5IPRIM | Automated imaging analysis software |
| 4x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320515 | |
| 10x Phase Contrast Objective | BioTek | BT1320516 | |
| LED Cube | BioTek | BT1225007 | |
| Filter Cube (DAPI) | BioTek | BT1225100 | DAPI |
| CFTRinh-172 | Selleck Chemicals | S7139 | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| IBMX | Sigma | I5879 | |
| Expansion Media | |||
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965 | |
| F12 Nutrient mix | ThermoFisher Scientific | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 16140-071 | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | ThermoFisher Scientific | PHG0314 | |
| Hydrocortisone (HC) | Sigma | H0888 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Adenine | Sigma | A2786 | |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012-02 | |
| Antibiotic Media | |||
| Ceftazidime | Alfa Aesar | J66460-03 | |
| Tobramycin | Alfa Aesar | J67340 | |
| Vancomycin | Alfa Aesar | J67251 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Differentiation Media | |||
| DMEM/F-12 (1:1) | ThermoFisher Scientific | 11330-32 | |
| Ultroser-G | Pall | 15950-017 | |
| Fetal Clone II | Hyclone | SH30066.03 | |
| Bovine Brain Extract | Lonza | CC-4098 | |
| Insulin | Sigma | I-9278 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H-0888 | |
| Triiodothyronine | Sigma | T-6397 | |
| Transferrin | Sigma | T-0665 | |
| Ethanolamine | Sigma | E-0135 | |
| Epinephrine | Sigma | E-4250 | |
| O-Phosphorylethanolamine | Sigma | P-0503 | |
| Retinoic Acid | Sigma | R-2625 | |
| Primary antibodies | |||
| Human CFTR antibody | R&D Systems | MAB1660 | Dilution: 100x |
| ZO-1 antibody | Thermo Fisher | MA3-39100-A647 | Dilution: 1000x |
| Anti-MUC5B antibody | Sigma | HPA008246 | Dilution: 100x |
| Anti-acetylated tubulin | Sigma | T7451 | Dilution: 100x |
| Anti-beta IV Tubulin antibody | Abcam | Ab11315 | Dilution: 100x |
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21202 | Dilution: 2000x |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A21207 | Dilution: 2000x |
References
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), (2018).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Brewington, J. J., et al. Detection of CFTR function and modulation in primary human nasal cell spheroids. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (1), 26-33 (2017).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Davidson, A. G. Cystic fibrosis and control nasal epithelial cells harvested by a brushing procedure. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 27 (9), 684-686 (1991).
- Bridges, M. A., Walker, D. C., Harris, R. A., Wilson, B. R., Davidson, A. G. Cultured human nasal epithelial multicellular spheroids: polar cyst-like model tissues. Biochemistry and Cell Biology. 69 (2-3), 102-108 (1991).
- Collie, G., Buchwald, M., Harper, P., Riordan, J. R. Culture of sweat gland epithelial cells from normal individuals and patients with cystic fibrosis. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 21 (10), 597-602 (1985).
- Conger, B. T., et al. Comparison of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and ciliary beat frequency activation by the CFTR Modulators Genistein, VRT-532, and UCCF-152 in primary sinonasal epithelial cultures. JAMA Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 139 (8), 822-827 (2013).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Gruenert, D. C., Basbaum, C. B., Widdicombe, J. H. Long-term culture of normal and cystic fibrosis epithelial cells grown under serum-free conditions. In Vitro Cellular & Developmental Biology. 26 (4), 411-418 (1990).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis. 7 (1), 44-53 (2008).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Guimbellot, J. S., et al. Nasospheroids permit measurements of CFTR-dependent fluid transport. JCI Insight. 2 (22), (2017).
- Liu, Z., et al. Human nasal epithelial organoids for therapeutic development in cystic fibrosis. Genes (Basel). 11 (6), (2020).
- Muller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2013).
- Dekkers, J. F., vander Ent, C. K., Beekman, J. M. Novel opportunities for CFTR-targeting drug development using organoids. Rare Diseases. 1, 27112 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Okiyoneda, T., et al. Mechanism-based corrector combination restores DeltaF508-CFTR folding and function. Nature Chemical Biology. 9 (7), 444-454 (2013).
- Schwank, G., et al. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).
- Geurts, M. H., et al. CRISPR-based adenine editors correct nonsense mutations in a cystic fibrosis organoid biobank. Cell Stem Cell. 26 (4), 503-510 (2020).
- Bove, P. F., et al. Breaking the in vitro alveolar type II cell proliferation barrier while retaining ion transport properties. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (4), 767-776 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. Journal of Clinical Investigation. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. The American Journal of Pathology. 180 (2), 599-607 (2012).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. The American Journal of Pathology. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Scudieri, P., et al. Ionocytes and CFTR chloride channel expression in normal and cystic fibrosis nasal and bronchial epithelial cells. Cells. 9 (9), (2020).
- Marthin, J. K., Stevens, E. M., Larsen, L. A., Christensen, S. T., Nielsen, K. G. Patient-specific three-dimensional explant spheroids derived from human nasal airway epithelium: a simple methodological approach for ex vivo studies of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 6, 3 (2017).
- Blouquit, S., et al. Ion and fluid transport properties of small airways in cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 174 (3), 299-305 (2006).
- Birket, S. E., et al. Combination therapy with cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators augment the airway functional microanatomy. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (10), 928-939 (2016).
- Birket, S. E., et al. A functional anatomic defect of the cystic fibrosis airway. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 190 (4), 421-432 (2014).
- Chu, K. K., et al. Particle-tracking microrheology using micro-optical coherence tomography. Biophysical Journal. 111 (5), 1053-1063 (2016).
- Chu, K. K., et al. et al. In vivo imaging of airway cilia and mucus clearance with micro-optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 7 (7), 2494-2505 (2016).
- Liu, L., et al. Method for quantitative study of airway functional microanatomy using micro-optical coherence tomography. PLoS One. 8 (1), 54473 (2013).
- Tuggle, K. L., et al. Characterization of defects in ion transport and tissue development in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-knockout rats. PLoS One. 9 (3), 91253 (2014).
- McCravy, M. S., et al. Personalised medicine for non-classic cystic fibrosis resulting from rare CFTR mutations. European Respiratory Journal. 56 (1), 2000062 (2020).
- Mutyam, V., et al. Therapeutic benefit observed with the CFTR potentiator, ivacaftor, in a CF patient homozygous for the W1282X CFTR nonsense mutation. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 24-29 (2017).
- Corning Inc. . CORNING CELL-TAK CELL AND TISSUE ADHESIVE. , (2013).
- Anderson, J. D., Liu, Z., Odom, L. V., Kersh, L., Guimbellot, J. S. CFTR function and clinical response to modulators parallel nasal epithelial organoid swelling. The American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 321 (1), 119-129 (2021).
- Biotek Instruments, Incorporated. . Lionheart FX Live Cell Imager Operator’s Manual. , (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Simmonds, N. J. Is it cystic fibrosis? The challenges of diagnosing cystic fibrosis. Paediatric Respiratory Reviews. 31, 6-8 (2019).
- McGarry, M. E., et al. In vivo and in vitro ivacaftor response in cystic fibrosis patients with residual CFTR function: N-of-1 studies. Pediatric Pulmonology. 52 (4), 472-479 (2017).
- Garratt, L. W., et al. Determinants of culture success in an airway epithelium sampling program of young children with cystic fibrosis. Experimental Lung Research. 40 (9), 447-459 (2014).
