안정화 핀을 가진 마우스 대퇴골의 횡단 골절
Summary
이 프로토콜은 성인 마우스에서 골절을 수행하고 치유 과정을 모니터링하는 방법을 설명합니다.
Abstract
골절 복구는 시험관 내에서 안정적으로 모델링 할 수없는 골격의 필수 기능입니다. 마우스 손상 모델은 뮤린 뼈가 인간의 골절 치유 중에 관찰 된 단계를 재구성하기 때문에 유전자, 유전자 제품 또는 약물이 뼈 복구에 영향을 미치는지 여부를 테스트하는 효율적인 접근 방식입니다. 마우스 또는 인간이 뼈를 부러 뜨리면 염증 반응이 시작되고 뼈 자체를 둘러싼 줄기 세포 틈새 인 골막이 활성화되고 확장됩니다. 골막에 상주하는 세포는 분화 후 혈관화된 연질 캘러스를 형성한다. 부드러운 캘러스에서 하드 캘러스로의 전환은 모집 된 골격 전구 세포가 미네랄 화 세포로 분화 될 때 발생하며, 골절 된 끝의 브리징은 뼈 연합을 초래합니다. 미네랄 화 된 굳은 살은 치유 된 뼈의 원래 모양과 구조를 복원하기 위해 리모델링을 거칩니다. 골절 치유는 다양한 부상 모델을 사용하여 마우스에서 연구되었습니다. 그럼에도 불구하고,이 전체 생물학적 과정을 재구성하는 가장 좋은 방법은 두 피질을 모두 포함하는 긴 뼈의 단면을 뚫는 것입니다. 이 프로토콜은 성인 마우스의 치유를 평가하기 위해 안정화 된 횡단 대퇴골 골절을 안전하게 수행 할 수있는 방법을 설명합니다. 골절 치유의 여러 단계를 특성화하기 위한 상세한 수확 및 이미징 기술을 포함하는 수술 프로토콜이 또한 제공된다.
Introduction
골절, 뼈 표면의 연속성의 파손은 인구의 모든 부분에서 발생합니다. 그들은 노화 나 질병으로 인해 깨지기 쉬운 뼈를 가진 사람들에게서 심각 해지고, 취약성 골절의 건강 관리 비용은 5 년 동안 250 억 달러를 초과 할 것으로 예상됩니다 1,2,3,4,5. 골절 복구와 관련된 생물학적 메커니즘을 이해하는 것은 치유 과정을 향상시키기위한 새로운 치료법을 개발하는 출발점이 될 것입니다. 이전의 연구에 따르면 골절시 뼈를 치유 할 수있는 네 가지 중요한 단계가 발생합니다 : (1) 혈종의 형성; (2) 섬유연골 캘러스의 형성; (3) 뼈를 형성하는 부드러운 캘러스의 미네랄화; 및 (4) 치유된 뼈의 리모델링 6,7. 골절을 성공적으로 치유하기 위해 많은 생물학적 과정이 활성화됩니다. 첫째, 급성 전염증 반응은 골절 6,7 직후에 개시된다. 그 후, 골막이 활성화되고 팽창되고, 연골세포가 연골세포로 분화하여 파쇄된 골 세그먼트 6,7,8,9에 의해 남겨진 틈새를 채우기 위해 성장하는 연골 캘러스를 형성한다. 신경 및 혈관 세포는 새로 형성된 캘러스를 침범하여 복구를 촉진하는 데 필요한 추가 세포 및 신호 전달 분자를 제공합니다 6,7,8,9,10. 굳은 살이 형성에 기여하는 것 외에도, periosteal 세포는 또한 브리징 캘러스에 짠 뼈를 내려 놓는 조골 세포로 분화됩니다. 마지막으로, 파골세포는 새로 형성된 뼈를 리모델링하여 원래의 모양과 라멜라 구조 7,8,9,10,11로 되돌아갑니다. 많은 그룹이 골절 복구의 마우스 모델을 개발했습니다. 마우스에서 가장 초기의 가장 자주 사용되는 골절 모델 중 하나는 Einhorn 접근법으로, 특정 높이12에서 다리에 체중이 떨어집니다. 골절을 유도하기 위해 가해지는 각도 및 힘에 대한 제어의 부족은 뼈의 위치 및 크기에 불연속성을 많이 생성한다. 이어서, 관찰된 특정 골절 치유 반응의 변이를 초래한다. 다른 대중적인 접근법은 경골 단피질 결함 또는 스트레스 골절을 생성하기 위한 외과적 개입, 비교적 가벼운 치유 반응을 유도하는 절차(10,13)이다. 이들 모델의 가변성은 주로 절차14를 수행하는 사람 때문이다.
여기서, 상세한 마우스 대퇴골 손상 모델은 재현 가능한 부상을 제공하고 대퇴골 골절 복구의 양적 및 질적 평가를 허용하기 위해 휴식에 대한 제어를 허용한다. 특히, 성인 마우스의 대퇴골에 완전한 돌파구가 도입되고 골절 끝을 안정화시켜 뼈 치유에서 물리적 로딩이 수행하는 역할을 설명합니다. 조직을 수확하고 조직학 및 미세 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)을 사용하여 치유 과정의 다양한 단계를 이미징하는 방법 또한 자세히 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 자세히 설명된 손상 모델은 (1) 혈종의 형성에 따른 전염증 반응, (2) 골막으로부터 부드러운 캘러스를 형성하기 위한 골격 전구물질의 모집, (3) 조골세포에 의한 굳은 살의 미네랄화 및 (4) 파골세포에 의한 뼈의 리모델링을 포함하여 자발적 골절의 치유 동안 관찰된 네 가지 중요한 단계를 모두 포함합니다.
이 원고에 설명 된 수술 절차는 적어도 12 주 된 성인 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 프로젝트에 대한 재정적 지원과지도에 대해 Vicki Rosen 박사에게 감사드립니다. 우리는 또한 멸균 기술, 동물 복지 및이 프로토콜을 개발하는 데 사용 된 재료에 관한 상담을 위해 하버드 의과 대학의 수의학 및 IACUC 직원에게 감사드립니다.
Materials
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
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