Fare Femurunun Stabilize Pin ile Enine Kırılması
Summary
Bu protokol, yetişkin farelerde kırıkları gerçekleştirmek ve iyileşme sürecini izlemek için bir yöntem açıklar.
Abstract
Kırık onarımı, iskeletin in vitro olarak güvenilir bir şekilde modellenemeyen önemli bir işlevidir. Bir fare yaralanması modeli, bir genin, gen ürününün veya ilacın kemik onarımını etkileyip etkilemediğini test etmek için etkili bir yaklaşımdır, çünkü murin kemikleri insan kırığı iyileşmesi sırasında gözlenen aşamaları özetler. Bir fare veya insan bir kemiği kırdığında, enflamatuar bir yanıt başlatılır ve kemiğin kendisini çevreleyen bir kök hücre nişi olan periost aktive edilir ve genişler. Periosteumda bulunan hücreler daha sonra vaskülarize yumuşak bir nasır oluşturmak için farklılaşır. Yumuşak nasırdan sert bir nasır geçişi, işe alınan iskelet progenitör hücreleri mineralize edici hücrelere farklılaştıkça gerçekleşir ve kırık uçların köprülenmesi kemik birliği ile sonuçlanır. Mineralize nasır daha sonra iyileşen kemiğin orijinal şeklini ve yapısını eski haline getirmek için yeniden şekillenir. Kırık iyileşmesi, çeşitli yaralanma modelleri kullanılarak farelerde incelenmiştir. Yine de, tüm bu biyolojik süreci özetlemenin en iyi yolu, her iki korteksi de kapsayan uzun bir kemiğin enine kesitini kırmaktır. Bu protokol, yetişkin farelerde iyileşmeyi değerlendirmek için stabilize edilmiş, enine bir femur kırığının nasıl güvenli bir şekilde gerçekleştirilebileceğini açıklar. Kırık iyileşmesinin farklı aşamalarını karakterize etmek için ayrıntılı hasat ve görüntüleme tekniklerini içeren bir cerrahi protokol de sağlanmaktadır.
Introduction
Kırıklar, kemik yüzeyinin sürekliliğindeki kırılmalar, popülasyonun tüm segmentlerinde meydana gelir. Yaşlanma veya hastalık nedeniyle kırılgan kemikleri olan kişilerde şiddetlenirler ve kırılganlık kırıklarının sağlık bakım maliyetlerinin 5 yıl içinde 25 milyar doları aşması beklenmektedir 1,2,3,4,5. Kırık onarımında yer alan biyolojik mekanizmaların anlaşılması, iyileşme sürecini iyileştirmeyi amaçlayan yeni tedavilerin geliştirilmesinde bir başlangıç noktası olacaktır. Önceki araştırmalar, kırık üzerine, kemiğin iyileşmesini sağlayan dört önemli adımın gerçekleştiğini göstermiştir: (1) hematom oluşumu; (2) fibrokıkırdaklı nasır oluşumu; (3) kemik oluşturmak için yumuşak nasırın mineralizasyonu; ve (4) iyileşmiş kemiğin yeniden şekillenmesi 6,7. Kırığı başarılı bir şekilde iyileştirmek için birçok biyolojik süreç aktive edilir. İlk olarak, bir kırık 6,7’den hemen sonra akut bir pro-inflamatuar yanıt başlatılır. Daha sonra, periost aktive olur ve genişler ve periosteal hücreler, bozulmuş kemik segmentlerinin 6,7,8,9 tarafından bırakılan boşluğu doldurmak için büyüyen bir kıkırdak nasır oluşturmak için kondrositlere farklılaşır. Nöral ve vasküler hücreler, onarımı kolaylaştırmak için gereken ek hücreleri ve sinyal moleküllerini sağlamak için yeni oluşan nasırları istila eder 6,7,8,9,10. Nasır oluşumuna katkıda bulunmanın yanı sıra, periosteal hücreler ayrıca köprüleme nasırında dokunmuş kemiği bırakan osteoblastlara da farklılaşır. Son olarak, osteoklastlar yeni oluşan kemiği orijinal şekline ve lamel yapısına 7,8,9,10,11 geri döndürmek için yeniden şekillendirir. Birçok grup kırık onarımı için fare modelleri geliştirdi. Farelerde daha erken ve en sık kullanılan kırık modellerinden biri, bacak üzerinde belirli bir yükseklikten12 ağırlık bırakıldığı Einhorn yaklaşımıdır. Açı üzerinde kontrol eksikliği ve kırığı indüklemek için uygulanan kuvvet, kemik süreksizliğinin yeri ve boyutunda çok fazla değişkenlik yaratır. Daha sonra, gözlenen spesifik kırık iyileşme yanıtında değişikliklere neden olur. Diğer popüler yaklaşımlar, tibial monokortikal defekt veya stres kırıkları üretmek için cerrahi müdahale, nispeten daha hafif iyileşme yanıtlarını indükleyen prosedürlerdir10,13. Bu modellerdeki değişkenlik öncelikle prosedürü uygulayan kişiden kaynaklanmaktadır14.
Burada, ayrıntılı bir fare femur yaralanması modeli, tekrarlanabilir bir yaralanma sağlamak ve femur kırığı onarımının kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin vermek için mola üzerinde kontrol sağlar. Spesifik olarak, yetişkin farelerin femurlarında tam bir atılım tanıtılır ve fiziksel yüklemenin kemik iyileşmesinde oynadığı rolü hesaba katmak için kırık uçlarını stabilize eder. Histoloji ve mikrobilgisayarlı tomografi (mikroBT) kullanılarak dokuların toplanması ve iyileşme sürecinin farklı adımlarının görüntülenmesi için yöntemler de ayrıntılı olarak verilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokolde detaylandırılan yaralanma modeli, spontan kırıkların iyileşmesi sırasında gözlenen dört önemli adımın tümünü kapsar: (1) hematom oluşumu ile pro-inflamatuar yanıt, (2) yumuşak nasır oluşturmak için periosteden iskelet progenitörlerinin işe alınması, (3) nasırın osteoblastlarla mineralizasyonu ve (4) kemiğin osteoklastlarla yeniden şekillendirilmesi.
Bu makalede açıklanan cerrahi prosedür, en az 12 haftalık yetişkin fareler için optimize edilmi?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Vicki Rosen’e projedeki finansal desteği ve rehberliği için teşekkür ederiz. Harvard Tıp Fakültesi’ndeki veterinerlik ve IACUC personeline steril teknik, hayvan refahı ve bu protokolü geliştirmek için kullanılan materyaller hakkında istişarelerde bulundukları için teşekkür ederiz.
Materials
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
- Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal osteoporosis. The New England Journal of Medicine. 374, 2096-2097 (2016).
- Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide. Bone. 104, 29-38 (2017).
- Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. Age-related bone loss and sarcopenia in men. Maturitas. 122, 51-56 (2019).
- NOF – Just for men. National Osteoporosis Foundation Available from: https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf (2019)
- Williams, S. A., et al. Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees. The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).
- Sheen, J. R., Garla, V. V. Fracture healing overview. StatPearls. , (2021).
- Holmes, D. Closing the gap. Nature. 550, 194-195 (2017).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9, 773 (2018).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopaedic Research. 37, 35-50 (2019).
- Li, Z., et al. Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves. Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).
- Hu, K., Olsen, B. R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).
- Collier, C. D., et al. Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy. Bone Reports. 12, 100250 (2020).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. European Cells & Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).
