Этот протокол описывает метод выполнения переломов на взрослых мышах и мониторинга процесса заживления.
Восстановление переломов является важной функцией скелета, которая не может быть надежно смоделирована in vitro. Модель травмы мыши является эффективным подходом к проверке того, влияет ли ген, генный продукт или лекарство на восстановление костей, потому что мышиные кости повторяют этапы, наблюдаемые во время заживления переломов человека. Когда мышь или человек ломает кость, инициируется воспалительная реакция, и надкостница, ниша стволовых клеток, окружающая саму кость, активируется и расширяется. Клетки, находящиеся в надкостнице, затем дифференцируются, образуя васкуляризированную мягкую мозоль. Переход от мягкой мозоли к твердой мозоли происходит, когда рекрутированные скелетные клетки-предшественники дифференцируются в минерализующие клетки, а мост сломанных концов приводит к объединению костей. Минерализованная мозоль затем подвергается ремоделированию, чтобы восстановить первоначальную форму и структуру зажившей кости. Заживление переломов было изучено на мышах с использованием различных моделей травм. Тем не менее, лучший способ повторить весь этот биологический процесс – прорваться через поперечное сечение длинной кости, которая охватывает обе коры. Этот протокол описывает, как стабилизированный поперечный перелом бедренной кости может быть безопасно выполнен для оценки заживления у взрослых мышей. Также предоставляется хирургический протокол, включающий подробные методы сбора и визуализации для характеристики различных этапов заживления переломов.
Переломы, разрывы в непрерывности костной поверхности, происходят во всех слоях населения. Они становятся тяжелыми у людей с хрупкими костями из-за старения или болезней, а расходы на здравоохранение при переломах хрупкости, как ожидается, превысят 25 миллиардов долларов через 5 лет 1,2,3,4,5. Понимание биологических механизмов, участвующих в восстановлении переломов, станет отправной точкой в разработке новых методов лечения, направленных на улучшение процесса заживления. Предыдущие исследования показали, что при переломе происходят четыре значительных шага, которые позволяют кости заживать: (1) образование гематомы; (2) образование фиброхрящевой мозоли; (3) минерализация мягкой мозоли с образованием кости; и 4) ремоделирование зажившей кости 6,7. Многие биологические процессы активизируются для успешного заживления перелома. Во-первых, острая провоспалительная реакция инициируется сразу после перелома 6,7. Затем надкостница активируется и расширяется, а периостальные клетки дифференцируются в хондроциты, образуя мозоль хряща, которая растет, чтобы заполнить пробел, оставленный нарушенными сегментамикости 6,7,8,9. Нервные и сосудистые клетки вторгаются во вновь образованную мозоль, чтобы обеспечить дополнительные клетки и сигнальные молекулы, необходимые для облегчения восстановления 6,7,8,9,10. В дополнение к содействию образованию мозоли, периостальные клетки также дифференцируются в остеобласты, которые откладывают тканую кость в мостовой мозоли. Наконец, остеокласты ремоделируют вновь образованную кость, чтобы вернуть свою первоначальную форму и пластинчатую структуру 7,8,9,10,11. Многие группы разработали мышиные модели восстановления переломов. Одной из более ранних и наиболее часто используемых моделей переломов у мышей является подход Эйнхорна, при котором вес падает на ногу с определенной высоты12. Отсутствие контроля над углом и силой, приложенной для индуцирования перелома, создает большую изменчивость в расположении и размере разрыва кости. Впоследствии это приводит к изменениям в специфической реакции заживления переломов. Другими популярными подходами являются хирургическое вмешательство для получения монокортикального дефекта большеберцовой кости или стрессовых переломов, процедуры, которые вызывают сравнительно более мягкие реакции заживления10,13. Изменчивость в этих моделях обусловлена в первую очередь человеком, проводящим процедуру14.
Здесь подробная модель травмы бедренной кости мыши позволяет контролировать разрыв, чтобы обеспечить воспроизводимую травму и позволить количественную и качественную оценку восстановления перелома бедренной кости. В частности, вводится полный прорыв в бедренных костях взрослых мышей и стабилизирует концы переломов, чтобы учесть роль физической нагрузки в заживлении костей. Также подробно представлены методы сбора тканей и визуализации различных этапов процесса заживления с использованием гистологии и микрокомпьютерной томографии (микроКТ).
Модель травмы, подробно описанная в этом протоколе, охватывает все четыре значительных этапа, наблюдаемых во время заживления спонтанных переломов, включая (1) провоспалительную реакцию с образованием гематомы, (2) набор скелетных предшественников из надкостницы для формирования мягко…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим д-ра Вики Розен за финансовую поддержку и руководство проектом. Мы также хотели бы поблагодарить ветеринаров и сотрудников IACUC в Гарвардской школе медицины за консультации относительно стерильной техники, благополучия животных и материалов, используемых для разработки этого протокола.
23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
Slow-release buprenorphine | Zoopharm |