Tværgående brud på museårbenet med stabiliserende stift

Summary

Denne protokol beskriver en metode til at udføre brud på voksne mus og overvåge helingsprocessen.

Abstract

Frakturreparation er en væsentlig funktion af skelettet, der ikke pålideligt kan modelleres in vitro. En museskademodel er en effektiv tilgang til at teste, om et gen, genprodukt eller lægemiddel påvirker knoglereparation, fordi murine knogler rekapitulerer de stadier, der observeres under helbredelse af menneskelige brud. Når en mus eller et menneske brækker en knogle, initieres en inflammatorisk reaktion, og periosteum, en stamcelleniche, der omgiver selve knoglen, aktiveres og udvides. Celler, der bor i periosteum, differentierer derefter for at danne en vaskulariseret blød callus. Overgangen fra den bløde callus til en hård callus sker, når de rekrutterede skeletstamceller differentierer sig til mineraliserende celler, og brobygningen mellem de brudte ender resulterer i knogleforeningen. Den mineraliserede callus gennemgår derefter ombygning for at genoprette den oprindelige form og struktur af den helede knogle. Frakturheling er blevet undersøgt hos mus ved hjælp af forskellige skadesmodeller. Alligevel er den bedste måde at rekapitulere hele denne biologiske proces på at bryde igennem tværsnittet af en lang knogle, der omfatter begge kortikater. Denne protokol beskriver, hvordan en stabiliseret, tværgående lårbensbrud sikkert kan udføres for at vurdere heling hos voksne mus. En kirurgisk protokol, der omfatter detaljerede høst- og billeddannelsesteknikker til at karakterisere de forskellige stadier af brudheling, er også tilvejebragt.

Introduction

Frakturer, brud i kontinuiteten af knogleoverfladen, forekommer i alle segmenter af befolkningen. De bliver alvorlige hos mennesker, der har skrøbelige knogler på grund af aldring eller sygdom, og sundhedsomkostningerne ved skrøbelighedsfrakturer forventes at overstige 25 milliarder dollars om 5 år 1,2,3,4,5. Forståelse af de biologiske mekanismer, der er involveret i reparation af brud, ville være et udgangspunkt for at udvikle nye terapier, der sigter mod at forbedre helingsprocessen. Tidligere forskning har vist, at der ved brud forekommer fire væsentlige trin, der gør det muligt for knoglen at helbrede: (1) dannelse af hæmatomet; (2) dannelse af en fibrocartilaginous callus; (3) mineralisering af den bløde callus til dannelse af knogle; og (4) ombygning af den helede knogle ^6,7. Mange biologiske processer aktiveres for at helbrede bruddet med succes. For det første initieres et akut proinflammatorisk respons umiddelbart efter et brud^{på 6,7}. Derefter aktiveres periosteum og udvides, og periosteale celler differentierer sig til chondrocytter for at danne en brusk callus, der vokser for at udfylde det hul, der efterlades af de forstyrrede knoglesegmenter 6,7,8,9. Neurale og vaskulære celler invaderer den nydannede callus for at tilvejebringe yderligere celler og signalmolekyler, der er nødvendige for at lette reparation ^6,7,8,9,10. Ud over at bidrage til callusdannelse differentierer periosteale celler sig også til osteoblaster, der lægger vævet knogle i brobygningscallus. Endelig ombygger osteoklaster den nydannede knogle for at vende tilbage til sin oprindelige form og lamellære struktur 7,8,9,10,11. Mange grupper udviklede musemodeller af brudreparation. En af de tidligere og oftest anvendte brudmodeller hos mus er Einhorn-tilgangen, hvor en vægt falder på benet fra en bestemt højde¹². Manglen på kontrol over vinklen og den kraft, der påføres for at fremkalde bruddet, skaber en masse variation i placeringen og størrelsen af knoglediskontinuiteten. Efterfølgende resulterer det i variationer i det specifikke frakturhelingsrespons, der observeres. Andre populære tilgange er kirurgisk indgreb for at producere en tibial monokortikal defekt eller stressfrakturer, procedurer, der inducerer forholdsvis mildere helbredende reaktioner^10,13. Variabilitet i disse modeller skyldes primært den person, der udfører proceduren¹⁴.

Her giver en detaljeret museknoglebenskademodel mulighed for kontrol over bruddet for at give en reproducerbar skade og muliggøre kvantitativ og kvalitativ vurdering af reparation af lårbensbrud. Specifikt introduceres et fuldstændigt gennembrud i lårbenene hos voksne mus og stabiliserer brudenderne for at tage højde for den rolle, fysisk belastning spiller i knogleheling. Metoderne til høst af væv og billeddannelse af de forskellige trin i helingsprocessen ved hjælp af histologi og mikrocomputertomografi (microCT) er også detaljeret angivet.

Protocol

Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee i Harvard Medical Area. 12 uger gamle C57BL/6J-mus (hanner og hunner) blev anvendt i denne protokol. C57BL/6J han- og hunmus opnår maksimal knoglemasse omkring 12 ugers alderen med lårben, der er brede nok til at passe til en stabiliserende stift, hvilket gør dem til en passende stamme at bruge til denne protokol15. 1. Forberedelse til operationen Autokl…

Representative Results

I C57BL / 6J-mus fuldender en vellykket operation de tidligere nævnte helingstrin med ringe eller ingen lokal inflammatorisk respons eller periosteal involvering i det sham-opererede kontralaterale lårben. Et hæmatom dannes et par timer efter operationen, og periosteum aktiveres for at rekruttere skeletstam til chondrogenese. Forskellige cellepopulationer, såsom Prx1+ mesenkymale forfædre, kan spores under reparationsprocessen ved hjælp af kommercielt tilgængelige fluorescerende reportermusmodeller (<st…

Discussion

Skadesmodellen, der er beskrevet i denne protokol, omfatter alle fire væsentlige trin, der observeres under helingen af spontane brud, herunder (1) proinflammatorisk respons med dannelsen af hæmatomet, (2) rekruttering af skeletstamfædre fra periosteum til dannelse af den bløde callus, (3) mineralisering af callus ved osteoblaster og (4) ombygning af knoglen ved osteoklaster.

Den kirurgiske procedure, der er beskrevet i dette manuskript, er optimeret til voksne mus, der er mindst 12 uger g…

Materials

23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle	BD precision	305193	Use as guide needle
27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm)	BD precision	305136	Use as stabilizing pin
9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit	Braintree Scientific, INC	ACS-KIT
Alcian Blue 8 GX	Electron Microscopy Sciences	10350
Ammonium hydroxide	Millipore Sigma	AX1303
Circular blade X926.7 THIN-FLEX	Abrasive technologies	CELBTFSG633
DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit	Dremel	7700 1/15
Eosin Y	ThermoScientific	7111
Fine curved dissecting forceps	VWR	82027-406
Hematoxulin Gill 2	Sigma-Aldrich	GHS216
Hydrochloric acid	Millipore Sigma	HX0603-4
Isoflurane	Patterson Veterinary	07-893-1389
Microsurgical kit	VWR	95042-540
Orange G	Sigma-Aldrich	1625
Phloxine B	Sigma-Aldrich	P4030
Povidone-Iodine Swabs	PDI	S23125
SCANCO Medical µCT35	Scanco
Slow-release buprenorphine	Zoopharm