带稳定针的小鼠股骨横断
Summary
该协议描述了一种对成年小鼠进行骨折并监测愈合过程的方法。
Abstract
骨折修复是骨骼的基本功能，无法在 体外可靠地建模。小鼠损伤模型是测试基因，基因产物或药物是否影响骨修复的有效方法，因为小鼠骨骼概括了在人类骨折愈合期间观察到的阶段。当小鼠或人类骨折时，炎症反应被启动，骨膜，围绕骨骼本身的干细胞生态位，被激活并扩张。然后，居住在骨膜中的细胞分化形成血管化的软愈伤组织。从软愈伤组织到硬愈伤组织的转变发生在新募集的骨骼祖细胞分化成矿化细胞时，骨折末端的桥接导致骨愈合。然后，矿化的愈伤组织进行重塑，以恢复愈合骨的原始形状和结构。已经使用各种损伤模型在小鼠中研究了骨折愈合。尽管如此，概括整个生物过程的最佳方法是突破包含两个皮质的长骨的横截面。该协议描述了如何安全地进行稳定的横贯性股骨骨折以评估成年小鼠的愈合情况。还提供了手术方案，包括详细的收获和成像技术，以表征骨折愈合的不同阶段。
Introduction
骨折，骨表面连续性的断裂，发生在人群的所有部分。由于衰老或疾病而骨骼脆弱的人，它们变得严重，脆性骨折的医疗保健费用预计将在5年内超过250亿美元1，2，3，4，5。了解骨折修复所涉及的生物学机制将是开发旨在增强愈合过程的新疗法的起点。以前的研究表明，骨折后，会发生四个重要步骤，使骨骼愈合：（1）血肿的形成;（2）形成纤维软骨愈伤组织;（3）软愈伤组织矿化形成骨骼;（4）愈合骨的重塑6，7。许多生物过程被激活以成功愈合骨折。首先，在骨折后立即启动急性促炎反应6，7。然后，骨膜被激活并扩张，骨膜细胞分化成软骨细胞以形成软骨愈伤组织，其生长以填充被破坏的骨节段6，7，8，9留下的间隙。神经和血管细胞侵入新形成的愈伤组织以提供促进修复所需的额外细胞和信号分子6，7，8，9，10。除了有助于愈伤组织形成外，骨膜细胞还分化成成成骨细胞，在桥接愈伤组织中铺设编织骨。最后，破骨细胞重塑新形成的骨骼以恢复到其原始形状和层状结构7，8，9，10，11。许多小组开发了骨折修复的小鼠模型。小鼠早期和最常用的骨折模型之一是Einhorn方法，其中重量从特定的高度12下降到腿上。缺乏对角度和用于诱导骨折的力的控制，导致骨不连续性的位置和大小产生很多可变性。随后，它导致观察到的特定骨折愈合反应的变化。其他流行的方法是手术干预以产生胫骨单皮质缺损或应力性骨折，这些手术诱导相对温和的愈合反应10，13。这些模型中的可变性主要是由于执行该过程的人14。
在这里，详细的小鼠股骨损伤模型允许控制断裂，以提供可重复的损伤，并允许对股骨骨折修复进行定量和定性评估。具体而言，在成年小鼠的股骨中引入完全突破并稳定骨折末端，以解释物理负荷在骨骼愈合中的作用。还详细介绍了使用组织学和显微计算断层扫描（microCT）采集组织和成像愈合过程不同步骤的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议中详述的损伤模型包括在自发性骨折愈合期间观察到的所有四个重要步骤，包括（1）随着血肿的形成而引起的促炎反应，（2）骨骼祖细胞从骨膜中募集形成软愈伤组织，（3）成骨细胞矿化愈伤组织，以及（4）破骨细胞重塑骨骼。
本手稿中描述的外科手术针对至少12周大的成年小鼠进行了优化。27 G x 1 1/4 （0.4 mm x 30 mm） 针头用作稳定针，因为它是这个年龄段骨髓腔宽?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Vicki Rosen博士对该项目的财政支持和指导。我们还要感谢哈佛医学院的兽医和IACUC工作人员就无菌技术，动物福祉以及用于开发该协议的材料进行咨询。
Materials
| 23 G x 1 TW IM (0.6 mm x 2 5mm) needle | BD precision | 305193 | Use as guide needle |
| 27 G x 1 ¼ (0.4 mm x 30 mm) | BD precision | 305136 | Use as stabilizing pin |
| 9 mm wound autoclip applier/remover/clips kit | Braintree Scientific, INC | ACS-KIT | |
| Alcian Blue 8 GX | Electron Microscopy Sciences | 10350 | |
| Ammonium hydroxide | Millipore Sigma | AX1303 | |
| Circular blade X926.7 THIN-FLEX | Abrasive technologies | CELBTFSG633 | |
| DREMEL 7700-1/15, 7.2 V Rotary Tool Kit | Dremel | 7700 1/15 | |
| Eosin Y | ThermoScientific | 7111 | |
| Fine curved dissecting forceps | VWR | 82027-406 | |
| Hematoxulin Gill 2 | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Hydrochloric acid | Millipore Sigma | HX0603-4 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Microsurgical kit | VWR | 95042-540 | |
| Orange G | Sigma-Aldrich | 1625 | |
| Phloxine B | Sigma-Aldrich | P4030 | |
| Povidone-Iodine Swabs | PDI | S23125 | |
| SCANCO Medical µCT35 | Scanco | ||
| Slow-release buprenorphine | Zoopharm |
References
- Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal osteoporosis. The New England Journal of Medicine. 374, 2096-2097 (2016).
- Curtis, E. M., Moon, R. J., Harvey, N. C., Cooper, C. The impact of fragility fracture and approaches to osteoporosis risk assessment worldwide. Bone. 104, 29-38 (2017).
- Laurent, M. R., Dedeyne, L., Dupont, J., Mellaerts, B., Dejaeger, M., Gielen, E. Age-related bone loss and sarcopenia in men. Maturitas. 122, 51-56 (2019).
- NOF – Just for men. National Osteoporosis Foundation Available from: https://cdn.nof.org/wp-content/uploads/2015/12/Osteoporosis-Fast-Facts.pdf (2019)
- Williams, S. A., et al. Economic burden of osteoporotic fractures in US managed care enrollees. The American Journal of Managed Care. 26, 142-149 (2020).
- Sheen, J. R., Garla, V. V. Fracture healing overview. StatPearls. , (2021).
- Holmes, D. Closing the gap. Nature. 550, 194-195 (2017).
- Duchamp de Lageneste, O., et al. Periosteum contains skeletal stem cells with high bone regenerative potential controlled by Periostin. Nature Communications. 9, 773 (2018).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopaedic Research. 37, 35-50 (2019).
- Li, Z., et al. Fracture repair requires TrkA signaling by skeletal sensory nerves. Journal of Clinical Investigation. 129, 5137-5150 (2019).
- Colnot, C., Thompson, Z., Miclau, T., Werb, Z., Helms, J. A. Altered fracture repair in the absence of MMP9. Development. 130, 4123-4133 (2003).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2, 97-101 (1984).
- Hu, K., Olsen, B. R. Osteoblast-derived VEGF regulates osteoblast differentiation and bone formation during bone repair. Journal of Clinical Investigation. 126, 509-526 (2016).
- Collier, C. D., et al. Characterization of a reproducible model of fracture healing in mice using an open femoral osteotomy. Bone Reports. 12, 100250 (2020).
- Glatt, V., Canalis, E., Stadmeyer, L., Bouxsein, M. L. Age-related changes in trabecular architecture differ in female and male C57BL/6J mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22, 1197-1207 (2007).
- Garcia, P., et al. A new technique for internal fixation of femoral fractures in mice: impact of stability on fracture healing. Journal of Biomechanics. 41, 1689-1696 (2008).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Garcia, P., et al. Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review. European Cells & Materials. 26 (1-12), 12-14 (2013).
- Histing, T., et al. Ex vivo analysis of rotational stiffness of different osteosynthesis techniques in mouse femur fracture. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1152-1156 (2009).
- Williams, J. N., Li, Y., Valiya Kambrath, A., Sankar, U. The Generation of closed femoral fractures in mice: A model to study bone healing. Journal of Visualized Experiments. (138), e58122 (2018).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38, 2131-2138 (2020).
