Her præsenterer vi en protokol, der beskriver viral transduktion af diskrete hjerneområder med optogenetiske konstruktioner for at muliggøre synapsespecifik elektrofysiologisk karakterisering i akutte gnaverhjerneskiver.
At studere de fysiologiske egenskaber ved specifikke synapser i hjernen, og hvordan de gennemgår plastiske ændringer, er en central udfordring i moderne neurovidenskab. Traditionelle in vitro elektrofysiologiske teknikker bruger elektrisk stimulering til at fremkalde synaptisk transmission. En stor ulempe ved denne metode er dens uspecifikke karakter; Alle axoner i området af den stimulerende elektrode aktiveres, hvilket gør det vanskeligt at tildele en effekt til en bestemt afferent forbindelse. Dette problem kan løses ved at erstatte elektrisk stimulering med optogenetisk baseret stimulering. Vi beskriver en metode til at kombinere optogenetik med in vitro patch-clamp optagelser. Dette er et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af både basal synaptisk transmission og synaptisk plasticitet af præcise anatomisk definerede synaptiske forbindelser og gælder for næsten enhver vej i hjernen. Her beskriver vi forberedelsen og håndteringen af et viralt vektorkodningskanalrhodopsinprotein til kirurgisk injektion i et præsynaptisk interesseområde (medial præfrontal cortex) i gnaverhjernen og fremstilling af akutte skiver af nedstrøms målregioner (lateral entorhinal cortex). En detaljeret procedure til kombination af patch-clamp-optagelser med synaptisk aktivering ved lysstimulering for at studere kort- og langsigtet synaptisk plasticitet præsenteres også. Vi diskuterer eksempler på eksperimenter, der opnår vej- og cellespecificitet ved at kombinere optogenetik og Cre-afhængig cellemærkning. Endelig beskrives histologisk bekræftelse af det præsynaptiske område af interesse sammen med biocytinmærkning af den postsynaptiske celle for at muliggøre yderligere identifikation af den nøjagtige placering og celletype.
At forstå synapsernes fysiologi og hvordan de gennemgår plastiske ændringer er grundlæggende for at forstå, hvordan hjernenetværk fungerer i den sunde hjerne1, og hvordan de fungerer i hjernesygdomme. Brugen af akutte ex vivo hjerneskiver gør det muligt at registrere den elektriske aktivitet af synapser fra enkelte neuroner med et højt signal-støj-forhold ved hjælp af helcelle-patch-clamp-optagelser. Kontrol af membranpotentiale og ligetil farmakologisk manipulation tillader isolering af receptorundertyper. Disse optagelser kan foretages med udsøgt specificitet for at identificere det postsynaptiske neuron, herunder laminær og subregional position2, cellulær morfologi3, tilstedeværelse af molekylære markører4, dets afferente fremskrivninger5, eller endda hvis det for nylig var aktivt6.
At opnå specificitet af præsynaptiske input er dog noget mere udfordrende. Den konventionelle metode har brugt stimuleringselektroder til at ophidse axonerne, der løber i en bestemt lamina. Et eksempel på dette er i hippocampus, hvor lokal stimulering i stratum radiatum aktiverer synapser, der projicerer fra CA3 til CA1-underfeltet7. I dette tilfælde opnås præsynaptisk specificitet, da CA3-input repræsenterer det eneste excitatoriske input placeret inden for stratum radiatum, der projicerer til CA1 pyramideceller8. Denne høje grad af inputspecificitet, der kan opnås med konventionel elektrisk præsynaptisk aktivering af CA3-CA1-axoner, er imidlertid en undtagelse, der afspejles i den intense undersøgelse, som denne synapse har været udsat for. I andre hjerneområder eksisterer axoner fra flere afferente veje sammen i den samme lamina, for eksempel i lag 1 af neocortex9, hvilket gør inputspecifik præsynaptisk stimulering umulig med konventionelle stimulerende elektroder. Dette er problematisk, da forskellige synaptiske input kan have divergerende fysiologiske egenskaber; Derfor kan deres co-stimulering føre til fejlkarakterisering af synaptisk fysiologi.
Fremkomsten af optogenetik, den genetiske kodning af lysfølsomme membranproteiner (opsiner) såsom channelrhodopsin-2 (ChR2), har muliggjort en enorm udvidelse af mulighederne for at studere isolerede synaptiske fremskrivninger mellem hjerneområder10,11. Her beskriver vi en generaliserbar og billig løsning til at studere langtrækkende synaptisk fysiologi og plasticitet. De optogenetiske konstruktioner leveres på en meget specifik måde ved hjælp af virale vektorer, der giver mulighed for ekstremt præcis kontrol af det præsynaptiske område af interesse. Efferente fremskrivninger vil udtrykke den lysaktiverede kanal, der muliggør aktivering af disse fibre i en målregion. Således kan langtrækkende, anatomisk diffuse veje, der ikke kan aktiveres uafhængigt af traditionel, ikke-specifik, elektrisk stimulering, studeres.
Vi beskriver, som et eksempel vej, transduktion af mediale præfrontale cortex (mPFC) med adeno-associerede vira (AAV’er), der koder for excitatoriske kation-kanal opsiner. Vi beskriver derefter forberedelsen af akutte skiver fra lateral entorhinal cortex (LEC), patch-clamp-optagelser fra lag 5 LEC pyramidale neuroner og let fremkaldt aktivering af glutamatergiske mPFC-LEC-fremskrivninger (figur 1). Vi beskriver også den histologiske vurdering af injektionsstedet for at bekræfte placeringen af det præsynaptiske område af interesse og identifikation af postsynaptisk cellemorfologi.
Protokollen, der præsenteres her, beskriver en metode til at udforske meget specifikke langtrækkende synaptiske fremskrivninger ved hjælp af en kombination af stereotaxisk kirurgi til at levere AAV’er, der koder for optogenetiske konstruktioner og elektrofysiologi i akutte hjerneskiver (figur 1). Sammen tilbyder disse teknikker værktøjer til at karakterisere fysiologien og plasticiteten af hjernekredsløb med høj præcision i langtrækkende og anatomisk diffuse veje, der tidligere var …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde støttes af Wellcome-bevillingen 206401/Z/17/Z. Vi vil gerne takke Zafar Bashir for hans ekspertmentorskab og Dr. Clair Booth for teknisk bistand og kommentarer til manuskriptet.
0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
Carbachol | Tocris | 2810 | |
Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
EGTA | Millpore | 324626 | |
Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
Emission filter | Chroma | 59022m | |
Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
Suture | Ethicon | W577H | |
Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
Solution | |||
aCSF | |||
sucrose cutting solution | |||
PFA | |||
Intracellular? |