Ex Vivo Interrogación optogenética de la transmisión sináptica de largo alcance y la plasticidad de la corteza prefrontal medial a la corteza entorrinal lateral
Summary
Aquí presentamos un protocolo que describe la transducción viral de regiones cerebrales discretas con construcciones optogenéticas para permitir la caracterización electrofisiológica específica de la sinapsis en cortes cerebrales agudos de roedores.
Abstract
Estudiar las propiedades fisiológicas de sinapsis específicas en el cerebro y cómo sufren cambios plásticos es un desafío clave en la neurociencia moderna. Las técnicas electrofisiológicas in vitro tradicionales utilizan la estimulación eléctrica para evocar la transmisión sináptica. Un inconveniente importante de este método es su naturaleza inespecífica; Todos los axones en la región del electrodo estimulante se activarán, lo que dificulta atribuir un efecto a una conexión aferente particular. Este problema se puede superar reemplazando la estimulación eléctrica con estimulación basada en la optogenética. Describimos un método para combinar la optogenética con registros in vitro de patch-clamp. Esta es una herramienta poderosa para el estudio tanto de la transmisión sináptica basal como de la plasticidad sináptica de conexiones sinápticas precisas definidas anatómicamente y es aplicable a casi cualquier vía en el cerebro. Aquí, describimos la preparación y el manejo de un vector viral que codifica la proteína canalrodopsina para la inyección quirúrgica en una región presináptica de interés (corteza prefrontal medial) en el cerebro de roedores y la fabricación de cortes agudos de regiones diana aguas abajo (corteza entorrinal lateral). También se presenta un procedimiento detallado para combinar las grabaciones de patch-clamp con la activación sináptica por estimulación lumínica para estudiar la plasticidad sináptica a corto y largo plazo. Discutimos ejemplos de experimentos que logran la especificidad de la vía y la célula combinando optogenética y etiquetado celular dependiente de Cre. Finalmente, se describe la confirmación histológica de la región presináptica de interés junto con el etiquetado de biocitina de la célula postsináptica, para permitir una mayor identificación de la ubicación precisa y el tipo de célula.
Introduction
Comprender la fisiología de las sinapsis y cómo sufren cambios plásticos es fundamental para comprender cómo funcionan las redes cerebrales en el cerebro sano1 y cómo funcionan mal en los trastornos cerebrales. El uso de cortes cerebrales agudos ex vivo permite el registro de la actividad eléctrica de las sinapsis de neuronas individuales con una alta relación señal-ruido utilizando grabaciones de pinza de parche de células enteras. El control del potencial de membrana y la manipulación farmacológica directa permiten el aislamiento de los subtipos de receptores. Estos registros pueden realizarse con exquisita especificidad para identificar la neurona postsináptica, incluyendo la posición laminar y subregional2, la morfología celular3, la presencia de marcadores moleculares4, sus proyecciones aferentes5, o incluso si estuvo activa recientemente6.
Sin embargo, lograr la especificidad de las entradas presinápticas es algo más difícil. El método convencional ha utilizado electrodos de estimulación para excitar los axones que corren en una lámina particular. Un ejemplo de esto es en el hipocampo donde la estimulación local en el estrato radiático activa sinapsis que se proyectan desde el CA3 hasta el subcampoCA1 7. En este caso, la especificidad presináptica se logra ya que la entrada CA3 representa la única entrada excitatoria ubicada dentro del estrato radiátum que se proyecta a las células piramidales CA18. Este alto grado de especificidad de entrada alcanzable con la activación presináptica eléctrica convencional de los axones CA3-CA1 es, sin embargo, una excepción que se refleja en el intenso estudio al que ha sido sometida esta sinapsis. En otras regiones del cerebro, los axones de múltiples vías aferentes coexisten en la misma lámina, por ejemplo, en la capa 1 del neocórtex9, lo que hace imposible la estimulación presináptica específica de entrada con electrodos estimulantes convencionales. Esto es problemático ya que diferentes entradas sinápticas pueden tener propiedades fisiológicas divergentes; Por lo tanto, su coestimulación puede conducir a una caracterización errónea de la fisiología sináptica.
El advenimiento de la optogenética, la codificación genética de proteínas de membrana fotosensibles (opsinas) como la canalrodopsina-2 (ChR2), ha permitido una gran expansión de las posibilidades para estudiar proyecciones sinápticas aisladas entre regiones cerebrales10,11. Aquí describimos una solución generalizable y de bajo costo para estudiar la fisiología sináptica de largo alcance y la plasticidad. Las construcciones optogenéticas se entregan de una manera altamente específica utilizando vectores virales que permiten un control extremadamente preciso de la región presináptica de interés. Las proyecciones eferentes expresarán el canal activado por la luz que permite la activación de estas fibras en una región objetivo. Por lo tanto, se pueden estudiar vías anatómicamente difusas de largo alcance que no pueden activarse independientemente mediante la estimulación eléctrica tradicional no específica.
Describimos, como vía de ejemplo, la transducción de la corteza prefrontal medial (mPFC) con virus adenoasociados (AAV) que codifican opsinas excitatorias de canales catiónicos. Luego describimos la preparación de cortes agudos de la corteza entorrinal lateral (LEC), registros de parche y pinza de neuronas piramidales LEC de capa 5 y activación evocada por luz de proyecciones glutamatérgicas mPFC-LEC (Figura 1). También describimos la evaluación histológica del lugar de inyección para confirmar la ubicación de la región presináptica de interés y la identificación de la morfología celular postsináptica.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí describe un método para explorar proyecciones sinápticas de largo alcance altamente específicas utilizando una combinación de cirugía estereotáxica para administrar AAV que codifican construcciones optogenéticas y electrofisiología en cortes cerebrales agudos (Figura 1). Juntas, estas técnicas ofrecen herramientas para caracterizar la fisiología y la plasticidad de los circuitos cerebrales con alta precisión en vías de largo alcance y anatómicamente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo cuenta con el apoyo de la subvención Wellcome 206401/Z/17/Z. Nos gustaría agradecer a Zafar Bashir por su tutoría experta y al Dr. Clair Booth por su asistencia técnica y comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3×1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera – Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 – 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
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