Inherent Dynamics Visualizer, eine interaktive Anwendung zur Bewertung und Visualisierung von Ergebnissen aus einer Gene Regulatory Network Inference Pipeline

Summary

Der Inherent Dynamics Visualizer ist ein interaktives Visualisierungspaket, das mit einem Genregulationsnetzwerk-Inferenzwerkzeug verbunden ist, um eine verbesserte, optimierte Generierung funktionaler Netzwerkmodelle zu ermöglichen. Der Visualizer kann verwendet werden, um fundiertere Entscheidungen für die Parametrisierung des Inferenzwerkzeugs zu treffen und so das Vertrauen in die resultierenden Modelle zu erhöhen.

Abstract

Die Entwicklung von genregulatorischen Netzwerkmodellen ist eine große Herausforderung in der Systembiologie. Mehrere Rechenwerkzeuge und Pipelines wurden entwickelt, um diese Herausforderung zu bewältigen, einschließlich der neu entwickelten Inherent Dynamics Pipeline. Die Inherent Dynamics Pipeline besteht aus mehreren zuvor veröffentlichten Tools, die synergistisch arbeiten und linear miteinander verbunden sind, wobei die Ausgabe eines Tools dann als Eingabe für das folgende Tool verwendet wird. Wie bei den meisten Berechnungstechniken erfordert jeder Schritt der Inherent Dynamics Pipeline, dass der Benutzer Entscheidungen über Parameter trifft, die keine genaue biologische Definition haben. Diese Entscheidungen können sich wesentlich auf die durch die Analyse erzeugten modelle des genregulatorischen Netzwerks auswirken. Aus diesem Grund kann die Fähigkeit, die Konsequenzen verschiedener Parameterauswahlen bei jedem Schritt zu visualisieren und zu untersuchen, dazu beitragen, das Vertrauen in die Entscheidungen und die Ergebnisse zu erhöhen. Der Inherent Dynamics Visualizer ist ein umfassendes Visualisierungspaket, das den Prozess der Bewertung der Parameterauswahl über eine interaktive Schnittstelle in einem Webbrowser rationalisiert. Der Benutzer kann die Ausgabe jedes Schritts der Pipeline separat untersuchen, intuitive Änderungen basierend auf visuellen Informationen vornehmen und von der automatischen Erstellung der erforderlichen Eingabedateien für die Inherent Dynamics Pipeline profitieren. Der Inherent Dynamics Visualizer bietet einen beispiellosen Zugang zu einem hochkomplizierten Werkzeug zur Entdeckung von genregulatorischen Netzwerken aus transkriptomischen Zeitreihendaten.

Introduction

Viele wichtige biologische Prozesse, wie Zelldifferenzierung und Umweltreaktion, werden von Gensätzen gesteuert, die in einem genregulatorischen Netzwerk (GRN) miteinander interagieren. Diese GRNs erzeugen die Transkriptionsdynamik, die für die Aktivierung und Aufrechterhaltung des von ihnen kontrollierten Phänotyps erforderlich ist, so dass die Identifizierung der Komponenten und der topologischen Struktur der GRN der Schlüssel zum Verständnis vieler biologischer Prozesse und Funktionen ist. Eine GRN kann als eine Reihe von interagierenden Genen und/oder Genprodukten modelliert werden, die durch ein Netzwerk beschrieben werden, dessen Knoten die Gene sind und dessen Kanten die Richtung und Form der Interaktion beschreiben (z. B. Aktivierung/Unterdrückung der Transkription, posttranslationale Modifikation usw.). ¹. Interaktionen können dann als parametrisierte mathematische Modelle ausgedrückt werden, die den Einfluss beschreiben, den ein regulierendes Gen auf die Produktion seiner Ziele ^hat2,3,4. Die Inferenz eines GRN-Modells erfordert sowohl eine Inferenz der Struktur des Interaktionsnetzwerks als auch eine Schätzung der zugrunde liegenden Interaktionsparameter. Es wurde eine Vielzahl von computergestützten Inferenzmethoden entwickelt, die Zeitreihen-Genexpressionsdaten aufnehmen und GRN-Modelle ^ausgeben5. Vor kurzem wurde eine neue GRN-Inferenzmethode namens Inherent Dynamics Pipeline (IDP) entwickelt, die Zeitreihen-Genexpressionsdaten verwendet, um GRN-Modelle mit markierten Regulator-Ziel-Interaktionen zu erzeugen, die in der Lage sind, Dynamiken zu erzeugen, die der beobachteten Dynamik in den Genexpressionsdaten ^entsprechen6. Der IDP ist eine Suite von Werkzeugen, die linear in eine Pipeline eingebunden sind und in drei Schritte unterteilt werden können: ein Node-Finding-Schritt, der Gene basierend auf Genexpressionsmerkmalen einstuft, von denen bekannt ist oder vermutet wird, dass sie mit der Funktion des ^GRN7,8 zusammenhängen, ein Edge Finding-Schritt, der paarweise regulatorische Beziehungen ^{bewertet8, 9} und ein Netzwerkfindungsschritt, der GRN-Modelle erzeugt, die in der Lage sind, die beobachtete Dynamik ^{zu erzeugen10,11,12,13,14,15}.

Wie die meisten Berechnungsmethoden erfordert der IDP eine Reihe von benutzerdefinierten Argumenten, die bestimmen, wie die Eingabedaten analysiert werden, und verschiedene Satz von Argumenten können unterschiedliche Ergebnisse für dieselben Daten liefern. Beispielsweise enthalten mehrere Methoden, einschließlich des IDP, Argumente, die einen Schwellenwert auf die Daten anwenden, und das Erhöhen/Verringern dieses Schwellenwerts zwischen aufeinanderfolgenden Ausführungen der jeweiligen Methode kann zu unterschiedlichen Ergebnissen zwischen den Durchläufen führen (siehe Ergänzungshinweis 10: Netzwerkinferenzmethoden ^von5). Zu verstehen, wie sich jedes Argument auf die Analyse und die nachfolgenden Ergebnisse auswirken kann, ist wichtig, um ein hohes Vertrauen in die Ergebnisse zu erreichen. Im Gegensatz zu den meisten GRN-Inferenzmethoden besteht der IDP aus mehreren Rechenwerkzeugen, von denen jedes seinen eigenen Satz von Argumenten hat, die ein Benutzer angeben muss, und jedes hat seine eigenen Ergebnisse. Während der IDP eine umfangreiche Dokumentation zur Parametrisierung der einzelnen Werkzeuge bereitstellt, macht die gegenseitige Abhängigkeit jedes Werkzeugs von der Ausgabe des vorherigen Schritts die Parametrierung der gesamten Pipeline ohne Zwischenanalysen zu einer Herausforderung. Beispielsweise basieren Argumente in den Schritten Edge und Network Finding wahrscheinlich auf biologischem Vorwissen und hängen daher vom Datensatz und/oder Organismus ab. Um Zwischenergebnisse abzufragen, wäre ein grundlegendes Verständnis der Programmierung sowie ein tiefes Verständnis aller Ergebnisdateien und ihrer Inhalte aus dem IDP erforderlich.

Der Inherent Dynamics Visualizer (IDV) ist ein interaktives Visualisierungspaket, das im Browserfenster eines Benutzers ausgeführt wird und Benutzern des IDP die Möglichkeit bietet, die Auswirkungen ihrer Argumentauswahl auf die Ergebnisse eines beliebigen Schritts im IDP zu bewerten. Der IDV navigiert durch eine komplizierte Verzeichnisstruktur, die vom IDP erzeugt wird, sammelt die notwendigen Daten für jeden Schritt und präsentiert die Daten in intuitiven und interaktiven Abbildungen und Tabellen, die der Benutzer erkunden kann. Nach dem Erkunden dieser interaktiven Displays kann der Benutzer neue Daten aus einem IDP-Schritt erstellen, die auf fundierteren Entscheidungen basieren können. Diese neuen Daten können dann sofort im nächsten entsprechenden Schritt des IDP verwendet werden. Darüber hinaus kann die Untersuchung der Daten helfen zu bestimmen, ob ein IDP-Schritt mit angepassten Parametern erneut ausgeführt werden sollte. Das IDV kann die Verwendung des IDP verbessern sowie die Verwendung des IDP intuitiver und zugänglicher machen, wie die Untersuchung des Kernoszillators GRN des Hefezellzyklus zeigt. Das folgende Protokoll enthält IDP-Ergebnisse aus einer vollständig parametrisierten IDP-Ausführung im Gegensatz zu einem Ansatz, der den IDV nach Den Ausführungen jedes IDP-Schritts, d. h. Knoten-, Edge- und Netzwerksuche, enthält.

Protocol

1. Installieren Sie den IDP und IDV

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird davon ausgegangen, dass docker, conda, pip und git bereits installiert sind (Tabelle der Materialien).

1. Geben Sie in einem Terminal den folgenden Befehl ein: git clone https://gitlab.com/biochron/inherent_dynamics_pipeline.git.
2. Befolgen Sie die Installationsanweisungen in der README-Datei des IDP.
3. Geben Sie in einem Terminal den Folgenden ein: git clone https://gitlab.com/bertfordley/inherent_dynamics_visualizer.git.
   HINWEIS: Das Klonen des IDV sollte außerhalb des Verzeichnisses der obersten Ebene des IDP erfolgen.
4. Befolgen Sie die Installationsanweisungen in der README-Datei des IDV.

2. Knotenfindung

1. Erstellen Sie eine neue IDP-Konfigurationsdatei, die den Schritt Knotensuche parametrisiert.
   HINWEIS: Alle Anführungszeichen in den folgenden Schritten sollten nicht eingegeben werden. Die Anführungszeichen werden hier nur als Trennzeichen zwischen dem Protokolltext und dem, was abgetippt werden soll, verwendet.
   1. Fügen Sie der Konfigurationsdatei die wichtigsten IDP-Argumente hinzu.
   2. Öffnen Sie eine neue Textdatei in einem Texteditor und geben Sie in einzelnen Zeilen "data_file =", "annotation_file =", "output_dir =", "num_proc =" und "IDVconnection = True" ein.
   3. Geben Sie für "data_file" nach dem Gleichheitszeichen den Pfad zu und den Namen der jeweiligen Zeitreihendatei ein und geben Sie ein Komma nach dem Namen ein. Trennen Sie jede Daten durch ein Komma, wenn mehr als ein Zeitreihendatensatz verwendet wird. Ein Beispiel für Zeitreihen-Genexpressionsdateien finden Sie unter Supplemental File 1 und Supplemental File 2 .
   4. Geben Sie nach dem Gleichheitszeichen den Pfad zu und den Namen der Anmerkungsdatei für "annotation_file" ein. Ein Beispiel für eine Anmerkungsdatei finden Sie unter Ergänzungsdatei 3 .
   5. Geben Sie für "output_file" nach dem Gleichheitszeichen den Pfad und den Namen des Ordners ein, in dem die Ergebnisse gespeichert werden.
   6. Geben Sie nach dem Gleichheitszeichen für "num_proc" die Anzahl der Prozesse ein, die der IDP verwenden soll.
   7. Fügen Sie der Konfigurationsdatei Node Finding-Argumente hinzu.
   8. Geben Sie in derselben Textdatei wie in Schritt 2.1.1 in der angegebenen Reihenfolge "[dlxjtk_arguments]", "periods =" und "dlxjtk_cutoff =" in einzelnen Zeilen ein. Platzieren Sie diese nach den Hauptargumenten.
   9. Wenn für "Perioden" nach dem Gleichheitszeichen einzugeben, wenn ein einmaliger Reihendatensatz verwendet wird, geben Sie jede Periodenlänge durch Kommas getrennt ein. Geben Sie für mehr als einen Zeitreihendatensatz jeden Satz von Periodenlängen wie zuvor ein, setzen Sie jedoch eckige Klammern um jeden Satz und setzen Sie ein Komma zwischen die Mengen.
   10. Geben Sie nach dem Gleichheitszeichen für "dlxjtk_cutoff" eine ganze Zahl ein, die die maximale Anzahl von Genen angibt, die in der gene_list_file von de Lichtenberg durch JTK_CYCLE (DLxJTK) (Tabelle 1) beibehalten werden sollen.
       HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, die dlxjtk_arguments Abschnitte in der IDP-README-Datei zu lesen, um ein besseres Verständnis der einzelnen Argumente zu erhalten. Ein Beispiel für eine Konfigurationsdatei mit den angegebenen Node Finding-Argumenten finden Sie unter Ergänzungsdatei 4 .
2. Wechseln Sie im Terminal in das IDP-Verzeichnis mit dem Namen inherent_dynamics_pipeline.
3. Geben Sie im Terminal den Folgenden ein: conda activate dat2net
4. Führen Sie den IDP mit der in Schritt 2.1 erstellten Konfigurationsdatei aus, indem Sie diesen Befehl im Terminal ausführen, wobei der Name der Datei ist: python src/dat2net.py
5. Wechseln Sie im Terminal in das Verzeichnis mit dem Namen inherent_dynamics_visualizer und geben Sie den folgenden Befehl ein: . /viz_results.sh
   HINWEIS: verweist auf das Verzeichnis, das als Ausgabeverzeichnis für den IDP verwendet wird.
6. Geben Sie in einem Webbrowser http://localhost:8050/ als URL ein.
7. Wenn der IDV nun im Browser geöffnet ist, klicken Sie auf die Registerkarte Node Finding und wählen Sie den gewünschten Node-Suchordner aus dem Dropdown-Menü aus.
8. Kuratieren Sie manuell eine neue Genliste aus der Genlistentabelle im IDV, die für nachfolgende IDP-Schritte verwendet werden soll.
   1. Um die Genlistentabelle zu erweitern oder zu kürzen, klicken Sie auf die Pfeile nach oben oder unten oder geben Sie manuell eine ganze Zahl zwischen 1 und 50 in das Feld neben Genexpression von DLxJTK-gene ein. Oben:.
   2. Klicken Sie in der Genlistentabelle auf das Kästchen neben einem Gen, um sein Genexpressionsprofil in einem Liniendiagramm anzuzeigen. Mehrere Gene können hinzugefügt werden.
   3. Geben Sie optional die Anzahl der gleich großen Behälter an, um Gene nach dem Zeitintervall zu berechnen und zu ordnen, das ihre Peakexpression enthält, indem Sie eine ganzzahlige Zahl in das Eingabefeld über der Genlistentabelle mit der Bezeichnung Input integer eingeben, um den ersten Zyklus in Behälter zu unterteilen:.
      HINWEIS: Diese Option ist spezifisch für die Schwingungsdynamik und möglicherweise nicht auf andere Arten von Dynamik anwendbar.
   4. Wählen Sie eine Heatmap-Anzeigeeinstellung aus, indem Sie auf eine Option unter Gene bestellen nach: Erster Zyklus Max Expression (Tabelle 1) klicken, die Gene basierend auf dem Zeitpunkt des Genexpressionspeaks im ersten Zyklus ordnet.
      HINWEIS: DLxJTK Rank ordnet Gene basierend auf dem Periodizitätsranking aus dem DLxJTK-Algorithmus des IDP.
   5. Klicken Sie auf die Schaltfläche Genliste herunterladen , um die Genliste in das Dateiformat herunterzuladen, das für den Schritt Edge Finding benötigt wird. Ein Beispiel für eine Genlistendatei finden Sie unter Ergänzungsdatei 5 .
9. Kennzeichnen Sie in der Bearbeitbaren Genanmerkungstabelle ein Gen als Ziel, Regulator oder beides in der Anmerkungsdatei für den Schritt Edge Finding in einem neuen Edge Finding-Lauf. Wenn ein Gen ein Regulator ist, markieren Sie das Gen als Aktivator, Repressor oder beides.
   1. Um ein Gen als Aktivator zu kennzeichnen, klicken Sie auf die Zelle in der Spalte tf_act und ändern Sie den Wert auf 1. Um ein Gen als Repressor zu kennzeichnen, ändern Sie den Wert in der Spalte tf_rep in 1. Ein Gen kann sowohl als Aktivator als auch als Repressor im Schritt Edge Finding fungieren, indem die Werte in den Spalten tf_act und tf_rep auf 1 gesetzt werden.
   2. Um ein Gen als Ziel zu kennzeichnen, klicken Sie auf die Zelle in der Zielspalte und ändern Sie den Wert auf 1.
10. Klicken Sie auf die Schaltfläche Anmerkung herunterladen, um die Anmerkungsdatei in das Für den Schritt Edge Finding benötigte Dateiformat herunterzuladen.

3. Edge-Suche

1. Erstellen Sie eine neue IDP-Konfigurationsdatei, die den Schritt Edgesuche parametrisiert.
   1. Fügen Sie der Konfigurationsdatei die wichtigsten IDP-Argumente hinzu. Öffnen Sie eine neue Textdatei in einem Texteditor und wiederholen Sie Schritt 2.1.1.
   2. Fügen Sie der Konfigurationsdatei Edge-Suchargumente hinzu.
   3. Geben Sie in derselben Textdatei wie in Schritt 3.1.1 in der angegebenen Reihenfolge "[lempy_arguments]", "gene_list_file =", "[netgen_arguments]", "edge_score_column =", "edge_score_thresho =", "num_edges_for_list =", "seed_threshold =" und "num_edges_for_seed =" in einzelnen Zeilen ein. Diese sollten unter die Hauptargumente gehen.
   4. Geben Sie für "gene_list_file" nach dem Gleichheitszeichen den Pfad und den Namen der in Schritt 2.8.5 generierten Genlistendatei ein.
   5. Geben Sie für "edge_score_column" nach dem Gleichheitszeichen entweder "pld" oder "norm_loss" ein, um anzugeben, welche Datenrahmenspalte aus der Lempy-Ausgabe zum Filtern der Kanten verwendet wird.
   6. Wählen Sie entweder "edge_score_threshold" oder "num_edges_for_list" und löschen Sie das andere. Wenn "edge_score_threshold" ausgewählt wurde, geben Sie eine Zahl zwischen 0 und 1 ein. Diese Nummer wird verwendet, um Kanten basierend auf der in Schritt 3.1.5 angegebenen Spalte zu filtern.
      1. Wenn "num_edges_for_list" ausgewählt wurde, geben Sie einen Wert ein, der gleich oder kleiner als die Anzahl der möglichen Kanten ist. Diese Nummer wird verwendet, um die Kanten basierend auf ihrer Rangfolge in der in Schritt 3.1.5 angegebenen Spalte zu filtern. Die verbleibenden Kanten werden verwendet, um Netzwerke in der Netzwerksuche aufzubauen.
   7. Wählen Sie entweder "seed_threshold" oder "num_edges_for_seed" und löschen Sie das andere. Wenn "seed_threshold" ausgewählt wurde, geben Sie eine Zahl zwischen 0 und 1 ein. Diese Nummer wird verwendet, um Kanten basierend auf der in Schritt 3.1.5 angegebenen Spalte zu filtern.
      1. Wenn "num_edges_for_seed" ausgewählt wurde, geben Sie einen Wert ein, der gleich oder kleiner als die Anzahl der möglichen Kanten ist. Diese Nummer wird verwendet, um die Kanten basierend auf ihrer Rangfolge in der in Schritt 3.1.5 angegebenen Spalte zu filtern. Die verbleibenden Kanten werden zum Erstellen des Seed-Netzwerks (Tabelle 1) verwendet, das in der Netzwerksuche verwendet wird.
         HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, die Abschnitte lempy_arguments und netgen_arguments in der IDP-README-Datei zu lesen, um ein besseres Verständnis der einzelnen Argumente zu erhalten. Ein Beispiel für eine Konfigurationsdatei mit den angegebenen Edge-Suchargumenten finden Sie unter Ergänzungsdatei 7 .
2. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 und 2.3.
3. Führen Sie den IDP mit der in Schritt 3.1 erstellten Konfigurationsdatei aus, indem Sie diesen Befehl im Terminal ausführen, wobei der Name der Datei ist: python src/dat2net.py
4. Wenn der IDV noch läuft, stoppen Sie ihn, indem Sie im Terminalfenster Control C drücken, um das Programm zu stoppen. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6.
5. Klicken Sie bei geöffnetem IDV im Browser auf die Registerkarte Edge-Suche und wählen Sie im Dropdown-Menü den gewünschten Edge-Suchordner aus.
   HINWEIS: Wenn in der Edgesuche mehrere Datasets verwendet werden, stellen Sie sicher, dass Sie das letzte Dataset auswählen, das in der LEM-Analyse (Local Edge Machine) verwendet wurde (Tabelle 1). Bei der Auswahl von Kanten für das Seed-Netzwerk oder die Edge-Liste auf der Grundlage von LEM-Ergebnissen ist es wichtig, die letzten in der Konfigurationsdatei aufgeführten Zeitreihendaten zu betrachten, da diese Ausgabe alle vorhergehenden Datendateien in ihre Rückschlüsse auf regulatorische Beziehungen zwischen Knoten einbezieht.
6. Um die Kantentabelle zu erweitern oder zu kürzen, geben Sie manuell eine Ganzzahl in das Eingabefeld unter Anzahl der Kanten: ein.
7. Filtern Sie optional Kanten nach den LEM-ODE-Parametern. Klicken und ziehen Sie, um entweder die linke Seite oder die rechte Seite des Schiebereglers jedes Parameters zu verschieben, um Kanten aus der Kantentabelle zu entfernen, deren Parameter außerhalb der neuen zulässigen Parametergrenzen liegen.
8. Erstellen Sie optional ein neues Seed-Netzwerk, wenn ein anderes Seed-Netzwerk als das vom IDP vorgeschlagene gewünscht wird. Ein Beispiel für eine Seed-Netzwerkdatei finden Sie unter Ergänzungsdatei 8 .
   1. Wählen Sie entweder Von Seed aus, um das Seed-Netzwerk auszuwählen, oder Aus Auswahl aus dem Dropdown-Menü unter Netzwerk:.
   2. Heben Sie die Auswahl von Kanten aus der Kantentabelle auf, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen neben jeder Kante aktivieren, um Kanten aus dem Ausgangsnetzwerk zu entfernen/hinzuzufügen.
9. Klicken Sie auf die Schaltfläche DSGRN NetSpec herunterladen , um das Seed-Netzwerk im Netzwerkspezifikationsformat Dynamic Signatures Generated by Regulatory Networks (DSGRN) (Tabelle 1) herunterzuladen.
10. Wählen Sie zusätzliche Knoten und Kanten aus, die im Schritt Netzwerksuche verwendet werden sollen.
    1. Wählen Sie Kanten aus der Kantentabelle aus, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen aktivieren, die in die in der Netzwerksuche verwendete Kantenlistendatei aufgenommen werden sollen.
    2. Klicken Sie auf Knoten- und Edgelisten herunterladen , um die Knotenlisten- und Edgelistendateien in dem Format herunterzuladen, das für ihre Verwendung in der Netzwerksuche erforderlich ist. Beispiele für Edge- bzw. Knotenlistendateien finden Sie unter Ergänzungsdatei 9 und Ergänzungsdatei 10 .
       HINWEIS: Die Knotenliste muss alle Knoten in der Kantenlistendatei enthalten, sodass der IDV die Knotenlistendatei automatisch basierend auf den ausgewählten Kanten erstellt. Zum Anzeigen der Kanten in der Kantensuche stehen zwei Optionen zur Verfügung. Die Option LEM-Übersichtstabelle stellt die Kanten als Rangliste der 25 besten Kanten dar. Die Top-Line-LEM-Tabelle präsentiert die Kanten in einer verketteten Liste der drei am besten bewerteten Kanten für jeden möglichen Regler. Die Anzahl der für jede Option angezeigten Kanten kann vom Benutzer angepasst werden, indem die Anzahl im Eingabefeld Anzahl der Kanten geändert wird.

4. Netzwerkfindung

1. Erstellen Sie eine neue IDP-Konfigurationsdatei, die den Schritt Netzwerksuche parametrisiert.
   1. Fügen Sie der Konfigurationsdatei die wichtigsten IDP-Argumente hinzu. Öffnen Sie eine neue Textdatei in einem Texteditor und wiederholen Sie Schritt 2.1.1.
   2. Fügen Sie der Konfigurationsdatei Argumente für die Netzwerksuche hinzu.
   3. Geben Sie in derselben Textdatei wie in Schritt 4.1.1 in der angegebenen Reihenfolge "[netper_arguments]", "edge_list_file =", "node_list_file =", "seed_net_file =", "range_operations =", "numneighbors =", "maxparams =", "[[probabilities]]", "addNode =", "addEdge =", "removeNode =" und "removeEdge =" in einzelnen Zeilen unterhalb der Hauptargumente ein.
   4. Geben Sie für "seed_net_file", "edge_list_file" und "node_list_file" nach dem Gleichheitszeichen den Pfad und den Namen der Seed-Netzwerkdatei sowie der Edge- und Knotenlistendateien ein, die in den Schritten 3.9 und 3.10.2 generiert wurden.
   5. Geben Sie nach dem Gleichheitszeichen für "range_operations" zwei durch ein Komma getrennte Zahlen ein. Die erste und zweite Zahl sind die minimale bzw. die maximale Anzahl des Hinzufügens oder Entfernens von Knoten oder Kanten pro Netzwerk.
   6. Geben Sie für "numneighbors" nach dem Gleichheitszeichen eine Zahl ein, die angibt, wie viele Netzwerke in der Netzwerksuche gesucht werden sollen.
   7. Geben Sie für "maxparams" nach dem Gleichheitszeichen eine Zahl ein, die die maximale Anzahl von DSGRN-Parametern für ein Netzwerk darstellt.
   8. Geben Sie werte zwischen 0 und 1 für jedes der folgenden Argumente ein: "addNode", "addEdge", "removeNode" und "removeEdge" nach dem Gleichheitszeichen. Die Zahlen müssen sich zu 1 summieren.
      HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, die Abschnitte netper_arguments und netquery_arguments in der IDP-README zu lesen, um ein besseres Verständnis der einzelnen Argumente zu erhalten. Beispiele für eine Konfigurationsdatei mit den angegebenen Netzwerkfindungsargumenten finden Sie unter Ergänzungsdatei 11 und Ergänzungsdatei 12 .
2. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 und 2.3.
3. Führen Sie den IDP mit der in Schritt 4.1 erstellten Konfigurationsdatei aus, indem Sie diesen Befehl im Terminal ausführen, wobei der Name der Datei ist: python src/dat2net.py
4. Wenn der IDV noch läuft, stoppen Sie ihn, indem Sie im Terminalfenster Control C drücken, um das Programm zu stoppen. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6.
5. Klicken Sie bei geöffnetem IDV im Browser auf die Registerkarte Netzwerksuche und wählen Sie den gewünschten Netzwerkordner aus.
6. Wählen Sie ein Netzwerk oder eine Gruppe von Netzwerken aus, um eine Edge-Prävalenztabelle (Tabelle 1) zu generieren und die Netzwerke zusammen mit ihren jeweiligen Abfrageergebnissen anzuzeigen.
   1. Für die Auswahl von Netzwerken stehen zwei Optionen zur Verfügung: Option 1 - Geben Sie untere und obere Grenzen für Abfrageergebnisse ein, indem Sie Minimal- und Maximalwerte in die Eingabefelder eingeben, die der x-Achse und der y-Achse des Diagramms entsprechen. Option 2 - Klicken und ziehen Sie über das Streudiagramm, um ein Feld um die einzuschließenden Netzwerke zu zeichnen. Nachdem Sie die Auswahl- oder Eingabegrenzen eingegeben haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Edge-Prävalenz aus ausgewählten Netzwerken abrufen .
      Hinweis: Wenn mehr als eine DSGRN-Abfrage angegeben wurde, verwenden Sie die Optionsfelder mit der Bezeichnung Abfragetyp, um zwischen den Ergebnissen der einzelnen Abfragen zu wechseln. Gleiches gilt, wenn mehr als ein Epsilon (Geräuschpegel) angegeben wurde.
7. Klicken Sie auf die Pfeile unter der Kantenprävalenztabelle, um zur nächsten Seite der Tabelle zu wechseln. Klicken Sie auf Tabelle herunterladen , um die Edge-Prävalenztabelle herunterzuladen.
8. Geben Sie eine Ganzzahl in das Eingabefeld Netzwerkindex ein, um ein einzelnes Netzwerk aus der in Schritt 4.6 getroffenen Auswahl anzuzeigen. Klicken Sie auf Download DSGRN NetSpec , um das angezeigte Netzwerk im DSGRN-Netzwerkspezifikationsformat herunterzuladen.
9. Durchsuchen Sie Netzwerke nach Ähnlichkeit mit einem bestimmten Motiv oder Interessensnetzwerk.
   1. Verwenden Sie die Kontrollkästchen, die jeder Kante entsprechen, um Kanten auszuwählen, die in das Netzwerk oder Motiv aufgenommen werden sollen, das bzw. das für die Ähnlichkeitsanalyse verwendet wird. Klicken Sie auf Senden , um das Ähnlichkeits-Streudiagramm für das ausgewählte Motiv oder Netzwerk zu erstellen.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Pfeile in der Kantenliste, um alphabetisch zu sortieren, und die Pfeile unter der Tabelle, um zur nächsten Seite der Tabelle zu wechseln.
   2. Klicken und ziehen Sie über das Streudiagramm, um ein Feld um die einzuschließenden Netzwerke zu zeichnen, um ein Netzwerk oder eine Gruppe von Netzwerken auszuwählen, um eine Kantenprävalenztabelle zu generieren und die Netzwerke zusammen mit ihren jeweiligen Abfrageergebnissen anzuzeigen.
      Hinweis: Wenn mehr als eine DSGRN-Abfrage angegeben wurde, verwenden Sie die Optionsfelder mit der Bezeichnung Abfragetyp, um zwischen den Ergebnissen der einzelnen Abfragen zu wechseln. Gleiches gilt, wenn mehr als ein Epsilon (Geräuschpegel) angegeben wurde.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 4.7 und 4.8, um die Kantenprävalenztabelle bzw. das angezeigte Netzwerk für die Ähnlichkeitsanalyse herunterzuladen.

Representative Results

Die oben und grafisch in Abbildung 1 beschriebenen Schritte wurden auf den oszillierenden Kern-GRN des Hefezellzyklus angewendet, um zu sehen, ob es möglich ist, funktionelle GRN-Modelle zu entdecken, die in der Lage sind, die Dynamik zu erzeugen, die in Zeitreihen-Genexpressionsdaten beobachtet wurde, die in einer Hefezellzyklusstudie gesammelt ^wurden16. Um zu veranschaulichen, wie der IDV den IDP-Output klären und verbessern kann, wurden die Ergebnisse nach der Durchführung dieser Analyse auf zwei Arten verglichen: 1) Ausführen aller Schritte des IDP in einem Durchgang ohne IDV und 2) Durchlaufen des IDP mit Hilfe des IDV, das die Anpassung von Zwischenergebnissen sowohl durch Einbeziehung früherer biologischer Kenntnisse als auch durch verfeinerte Entscheidungen auf der Grundlage von IDP-Outputs ermöglicht. Der am Beispiel gut untersuchte Hefezellzyklus GRN hat viele seiner regulatorischen Beziehungen experimentell verifiziert. Wenn ein anderer und/oder weniger annotierter Organismus oder biologischer Prozess untersucht wird, können die Entscheidungen darüber, wie Zwischenergebnisse oder Parameter angepasst werden, unterschiedlich sein. Um eine Art von Abfrage zu veranschaulichen, die zur Bewertung von Netzwerken verwendet werden kann, wurde die Robustheit jedes Netzwerks gemessen, um stabile Schwingungen zu unterstützen und die beobachtete Transkriptionsdynamik ihrer Knoten über Modellparameter hinweg abzugleichen.

Genexpressionszeitreihendaten von zwei Replikationsreihen wurden aus Orlando ²⁰⁰⁸¹⁶ entnommen und vorverarbeitet, um jegliche Genexpression zu entfernen, die mit der im ursprünglichen Experiment angewendeten Zellzyklus-Synchronisationsmethode assoziiert ist (Supplemental File 1 und Supplemental File 2). Es wurde eine Annotationsdatei erstellt, die alle Gene in den Zeitreihendaten enthält, die sowohl durch DNA-Bindungs- als auch durch Expressionsnachweise in ^Yeastract17 unterstützt werden und somit als Regulator in einem GRN fungieren könnten. TOS4, PLM2 und NRM1 wurden ebenfalls als Regulatoren aufgenommen, obwohl sie in Yeastract nicht gefunden wurden, um beide Arten von Beweisen zu haben, weil sie aufgrund von Beweisen in der Literatur als wichtig für den Hefekern GRN angesehen ^werden18,19 (Supplemental File 3). Alle Regulatoren wurden sowohl als Aktivator und Repressor als auch als Targets gekennzeichnet.

Der IDP wurde zunächst parametrisiert, um alle Schritte des IDP zu durchlaufen, d. h. Knoten-, Edge- und Netzwerksuche. Es wurde eine Reihe von Argumenten ausgewählt, die auf der Grundlage des aktuellen Verständnisses des Hefezellzyklus GRN, einer kleinen Gruppe von Genen, die an einem stark verbundenen Netzwerk beteiligt sind, angemessen erschien (Supplemental File 4). Dieses Verständnis beeinflusste hauptsächlich die Node- und Edge-Finding-Entscheidungen. Die Wahrscheinlichkeitsparameter in Network Finding basierten auf der Annahme, dass nur wahre Gene und regulatorische Interaktionen an Network Finding weitergegeben würden. Dieser vollständig parametrisierte Lauf des IDP führte zu Ergebnissen für die Knoten- und Kantensuche (Abbildung 2B,C), aber in der Netzwerkfindung wurden keine modellfähigen Netzwerke entdeckt (Abbildung 2A,D). Die Modellüberlässigkeit wird in der Codedokumentation des Python-Moduls dsgrn_net_gen ¹⁴, einer Abhängigkeit des IDP, erläutert. Kurz gesagt, Netzwerke, die selbstverdrängende Kanten enthalten oder zu viele Ein- oder Ausgänge an einem einzelnen Knoten haben, können von der DSGRN-Software nicht abgefragt werden (Tabelle 1). Der IDP nennt viele Gründe, warum modellzulässige Netzwerke möglicherweise nicht gefunden werden, und beschreibt Schritte zur Fehlerbehebung, um das Problem (die Probleme) zu beheben. Im Wesentlichen geht es darum, Parameter und/oder Eingabedateien zu ändern und den jeweiligen IDP-Schritt erneut auszuführen und die Ergebnisse zu untersuchen. Der IDV wurde verwendet, um diesen Prozess weniger mühsam und zeitaufwendig zu gestalten.

Die Node Finding-Ergebnisse wurden in das IDV geladen, um die Gene zu untersuchen, die an den Edge-Finding-Schritt des IDP übergeben wurden. Die von IDP angegebenen Knoten sind die Top-N-Gene, wie von DLxJTK (Tabelle 1) eingestuft, wobei N vom Benutzer angegeben wird, diese Genliste ist jedoch möglicherweise nicht für das Ziel der Analyse geeignet. Ohne vorheriges biologisches Wissen lieferte die automatische Selektion von Knoten, die nur DLxJTK-Scores verwendete, ein Gen mit begrenzten Hinweisen auf eine Rolle im Hefezellzyklus (RME1), während einige bekannte Transkriptionsregulatoren des Zellzyklus nicht hoch eingestuft wurden (Abbildung 2B). Yeastract experimentelle Beweise wurden verwendet, um aus den ranghöchsten Genen von DLxJTK diejenigen mit Zellzyklus-Annotation auszuwählen. Diese Gene sind SWI4, YOX1, YHP1, HCM1, FKH2, NDD1 und SWI5. Ihre bekannten regulatorischen Beziehungen sind in Abbildung 3 dargestellt. FKH2 erscheint nicht in den Top-Ten-Genen (dlxjtk_cutoff wurde in Supplemental File 4 auf zehn gesetzt), wie von DLxJTK eingestuft, so dass die Genliste mit dem IDV erweitert wurde, bis FKH2 gefunden wurde (Abbildung 4). Einige der zusätzlichen Gene in der erweiterten Genliste sind bekannte Kerngene und wären ohne Untersuchung der Node Finding-Ergebnisse übersehen worden. Während bekanntere Kerngene durch Erweiterung der Genliste in der DLxJTK-Rangliste gefunden wurden, wurde der Fokus auf die Gene von Interesse gelegt. Daher wurden einige hochrangige Gene abgewählt, was zu einer Genliste (Supplemental File 5) führte, die sieben Gene enthielt (Abbildung 4). Basierend auf diesen sieben Genen wurde eine neue Anmerkungsdatei erstellt (Supplemental File 6), jedes Gen wurde als Ziel markiert und der Regulatortyp wurde mit Yeastract spezifiziert. Die neue Genliste und die Anmerkungsdatei wurden zur späteren Verwendung im nächsten IDP-Schritt, Edge Finding, heruntergeladen. Ohne das IDV würde das Verfahren zum Hinzufügen und Entfernen von Genen aus der Genliste und der Anmerkungsdatei bescheidene Kodierungsfähigkeiten erfordern.

Eine neue IDP-Konfigurationsdatei wurde nur für den Edge-Finding-Schritt (Supplemental File 7) mit der neuen Genliste und der Annotationsdatei parametrisiert. Nach Abschluss des IDP mit der neuen Konfigurationsdatei wurden die Ergebnisse in den IDV geladen (Abbildung 5A). Da der Schritt Network Finding stochastisch den Netzwerkraum des ihm zur Verfügung gestellten Seed-Netzwerks durchsucht, kann die Bereitstellung eines guten Seed-Netzwerks wichtig sein. Ein gutes Seed-Netzwerk kann man sich als eines vorstellen, das echte Kanten enthält. Mit dem IDV und unter Verwendung von Online-Datenbanken wie Yeastract und der Saccharomyces Genome Database (SGD)²⁰ kann das Saatgutnetzwerk anhand der regulatorischen Beziehungen aus LEM (Tabelle 1), die experimentelle Beweise haben, eingesehen und angepasst werden. Als Beispiel wurde die Kante YHP1 = tf_act(HCM1) abgewählt, da es keine dokumentierten Beweise für diesen Zusammenhang (Abbildung 5B) in Yeastract gibt. Die Kante SWI5 = tf_act(FKH2) wurde hinzugefügt, da es dokumentierte Beweise für diese Beziehung ^gibt21. Sobald das Ausgangsnetzwerk (Tabelle 1) zufriedenstellend war, wurde die DSGRN-Netzwerkspezifikationsdatei für das Netzwerk heruntergeladen (Ergänzende Datei 8).

Ohne das IDV besteht eine höhere Wahrscheinlichkeit, dass Kanten, für die es keine experimentellen Beweise gibt, verwendet werden, um das Samennetzwerk zu konstruieren. Wie in Abbildung 2C zu sehen ist, enthält das Seed-Netzwerk, das im Edge Finding-Schritt generiert wird, indem der IDP nonstop durch jeden Schritt ausgeführt wird, eine Kante, SWI4 = tf_rep (NDD1), die nicht durch experimentelle Beweise in Yeastract unterstützt wird, wahrscheinlich weil NDD1 als transkriptioneller Aktivator bekannt ^ist22. Diese Informationen wurden in der Annotationsdatei im Non-Stop-Lauf nicht kodiert, wodurch alle Regler sowohl Aktivatoren als auch Repressoren sein konnten.

Mit dem IDV wurde manuell ein Seed-Netzwerk kuratiert, das ein Subnetz von Abbildung 3 ist, und die verbleibenden vier Kanten wurden in die Kantenliste eingefügt, die für die Stichprobe des Netzwerkraums verwendet wurde (YHP1 = tf_act (SWI4), YOX1 = tf_act (SWI4), SWI4 = tf_rep (YOX1), SWI5 = tf_act (NDD1)). Die Auswahl von Kanten auf der Grundlage biologischer Vorkenntnisse kann auch zum Erstellen der Kantenliste verwendet werden. In diesem Fall wurden jedoch die oberen 20 Kanten aus der Ansicht LEM-Zusammenfassungstabelle ausgewählt (Ergänzungsdatei 9). Die Knotenlistendatei wird automatisch aus den ausgewählten Kanten erstellt (Ergänzende Datei 10). Die ODE-Parameter aus LEM können auch verwendet werden, um Kanten zu filtern, wenn man glaubt, dass die abgeleiteten Parameter im ODE-Modell biologisch nicht realistisch sind, aber diese Informationen wurden hier nicht verwendet.

Als Nächstes wurde eine neue IDP-Konfigurationsdatei für den Schritt Netzwerksuche unter Verwendung der drei neuen Dateien parametrisiert. Da das Samennetzwerk mit Kanten erstellt wurde, die durch experimentelle Beweise gut unterstützt wurden, war die Einbeziehung dieser Kanten in alle Netzwerke wünschenswert. So wurden die Network Finding-Wahrscheinlichkeiten so eingestellt, dass sie das Hinzufügen, aber nicht das Entfernen von Knoten und Kanten ermöglichen (Supplemental File 11). Der Netzwerkfindungsparameter numneighbors wurde festgelegt, um nach 2.000 Netzwerken zu suchen. Nach dem Ausführen des IDP wurden im Schritt "Netzwerkfindung" 37 modellfähige Netzwerke gefunden, im Gegensatz zu dem Ununterbrochen-Lauf mit Null. Beim Laden der Ergebnisse der Netzwerkfindung in das IDV hatten 64 % (24) dieser 37 Netzwerke die Fähigkeit, stabil zu oszillieren (Abbildung 6A). Von diesen 24 Netzwerken waren die besten Performer zwei Netzwerke, die die Daten bei 50% ihrer stabil oszillierenden Modellparameter übereinstimmten (Abbildung 6B).

Die Edge-Prävalenztabelle (Tabelle 1) tabelliert die Häufigkeit, mit der ein Edge in einer ausgewählten Sammlung von Netzwerken auftritt, und gibt einen Hinweis auf seine Prävalenz in leistungsstarken Netzwerken. Die Untersuchung der Edge-Prävalenztabelle, die durch Auswahl der beiden vorherigen Netzwerke im Streudiagramm erstellt wurde, zeigt, dass alle Seed-Netzwerk-Edges wie erwartet in jedem der beiden Netzwerke vorhanden sind, zusammen mit zwei Nicht-Seed-Netzwerk-Edges (Abbildung 6B), SWI4 = tf_act (SWI5) und HCM1 = tf_rep (YHP1). Keine dieser beiden Kanten hatte Beweise, die sie in Yeastract unterstützten. Da eine so kleine Menge an Netzwerkraum erforscht wurde, ist es schwierig, die Bedeutung von Kanten und Knoten für die Erzeugung der beobachteten Dynamik zu beurteilen.

Nur 37 modellfähige Netzwerke wurden in Network Finding gefunden, obwohl der Parameter numneighbors auf 2.000 gesetzt war, was darauf hindeutet, dass die Netzwerksuche möglicherweise übermäßig eingeschränkt war. Wie in der Dokumentation für das dsgrn_net_gen Python-Modul im IDP beschrieben, kann das Problem mit dem Seed-Netzwerk, der Edge-Liste, der Knotenliste, der Netzwerkfindungsparameterauswahl oder einer Kombination davon zusammenhängen. Zur Untersuchung wurden das gleiche Ausgangsnetzwerk, die gleiche Edgeliste und die gleiche Knotenliste wie zuvor verwendet, aber die Parameter für die Netzwerksuche wurden geändert, indem die Möglichkeit hinzugefügt wurde, Kanten während der Netzwerkgenerierung zu entfernen (Ergänzende Datei 12). Das Laden der neuen Network Finding-Ergebnisse in das IDV zeigt, dass in diesem Schritt 612 Netzwerke gefunden wurden, wobei 67% (411) dieser Netzwerke die Fähigkeit hatten, stabil zu oszillieren (Abbildung 7A). Interessanterweise waren 13% (82) der Netzwerke, die zu einer stabilen Schwingungsdynamik fähig waren, nicht in der Lage, eine ähnliche Dynamik wie in den Daten zu erzeugen (Abbildung 7B). Von den 411 Netzwerken wiesen 30% (124) robuste Übereinstimmungen mit Daten auf (d. h. mehr als 50% ihrer stabil oszillierenden Modellparameter wiesen eine Datenübereinstimmung auf) (Abbildung 7C).

Die durch die zweite Runde von Network Finding generierten Edge-Prävalenzzahlen basieren nun auf einer viel größeren Auswahl von Netzwerken und können sicherer verwendet werden, um die Bedeutung einer regulatorischen Beziehung in einem GRN zu bewerten. Zum Beispiel ist HCM1 = tf_rep (YHP1) in Netzwerken, die eine robuste Dynamik erzeugen, immer noch hoch vertreten, was darauf hindeutet, dass diese Beziehung es wert sein könnte, experimentell untersucht zu werden (Abbildung 7C). Eine weitere Untersuchung der Edge Prevalence Table (basierend auf den oben genannten 124 Netzwerken) ergab, dass die Kanten SWI4 = tf_rep (YOX1) und YOX1 = tf_act (SWI4) nicht hoch eingestuft sind, die Kanten SWI4 = tf_rep (YHP1) und YHP1 = tf_act (SWI4) sind jedoch hoch eingestuft (Abbildung 7C). Negative Rückkopplung ist wichtig für die Erzeugung von ^{Schwingungsdynamik23} , und beide Sätze von regulatorischen Beziehungen bieten diese Funktion im GRN in Abbildung 3. Die Feststellung, ob ein Netzwerk existiert, das alle vier dieser Kanten enthält, könnte einen Einblick geben, warum diese in der Sammlung von GRN-Modellen nicht häufig zusammen existieren. Das Durchklicken einzelner Netzwerke wäre jedoch mühsam. Stattdessen wurde der Teil Ähnlichkeitsanalyse der Seite Netzwerksuche verwendet, um nach Netzwerken zu suchen, die alle vier Kanten enthalten können (Abbildung 7D). Die Untersuchung des Streudiagramms, das zeigt, wie ähnlich die 612 Netzwerke einem Motiv dieser vier Kanten im Vergleich zum Prozentsatz des Modellparameterraums sind, der der beobachteten Dynamik entspricht, zeigt, dass nur 0,65% (4) der 612 Netzwerke alle vier dieser Kanten enthalten (Abbildung 7D). Dies legt eine überprüfbare Hypothese nahe, dass nur eine der beiden negativen Rückkopplungsschleifen benötigt wird, damit ein Netzwerk dieser Größe die beobachtete Dynamik erzeugen kann. Diese Hypothese kann rechnerisch durch Reparametrisierung von IDP-Schritten und eine umfassendere Suche im Netzwerkraum oder experimentell, wie z.B. Gen-Knockouts, weiter untersucht werden. Alle Ergebnisse dieser Analyse finden Sie in Supplemental File 13.

Abbildung 1: Übersicht über IDP- und IDV-Workflows. In der unteren Zeile werden die drei Hauptschritte des IDP dargestellt: Knoten-, Edge- und Netzwerksuche. Die oberste Zeile zeigt die wichtigsten Schritte des IDV und beschreibt verschiedene Möglichkeiten, wie ein Benutzer mit den Ergebnissen interagieren kann. Die dunkelgrauen Pfeile zwischen den beiden zeigen, wie der IDV und der IDP synergistisch zusammenarbeiten können, damit Benutzer fundierte Entscheidungen für jeden Schritt des IDP treffen können, wobei einzelne IDP-Schritte Ergebnisse für die Visualisierungen im IDV liefern, einzelne IDV-Schritte die Eingabe neuer oder angepasster Parameter ermöglichen und angepasste Ergebnisse und Eingaben für den nachfolgenden IDP-Schritt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Beispiel für Ergebnisse beim Ausführen jedes Schritts des IDP nacheinander, ohne den IDV zwischen den Schritten zu verwenden. (A) Ein Screenshot der Terminalausgabe, wenn jeder IDP-Schritt nacheinander ausgeführt wird. Der IDP wurde bis zum Abschluss ausgeführt, aber während des Schritts "Netzwerksuche" wurden keine Netzwerke gefunden. (B) Node Finding Ergebnisverzeichnis node_finding_20210705183301 (Supplemental File 13) in den IDV geladen. Alle Gene in der Genlistentabelle wurden ausgewählt (roter Pfeil), um ihre jeweiligen Expressionsprofile im Liniendiagramm anzuzeigen und eine Anmerkungstabelle zu generieren. Die Anmerkungstabelle wurde ausgefüllt, um widerzuspiegeln, wie die Gene in der ursprünglichen Anmerkungsdatei (grüner Pfeil) gekennzeichnet sind. (C) Edge Finding Ergebnisverzeichnis edge_finding_20210705183301 (Supplemental File 13) in den IDV geladen. (D) Network Finding results directory network_finding_20210705183301 (Supplemental File 13) in den IDV geladen. Auf der Seite Netzwerksuche werden keine Ergebnisse angezeigt, was darauf hindeutet, dass entweder eine Neuparametrisierung des Schritts "Netzwerksuche" oder eine Neubewertung des Schritts "Knoten- oder Edgesuche" erforderlich ist. Die IDP-Dokumentation enthält Schritte zur Problembehandlung, mit denen der Benutzer bestimmen kann, was er als nächstes versuchen könnte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Ein Hefezellzyklus-GRN-Modell. Eine Reihe bekannter Hefezellzyklus-Regulatoren wurde aus SGD ausgewählt und bekannte regulatorische Beziehungen zwischen Genen wurden aus Yeastract extrahiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Beispiel für IDP-Knotenermittlungsergebnisse im IDV. In den IDV geladen wird das Ergebnisverzeichnis Node Finding node_finding_20210705183301 (Supplemental File 13). Die angepassten Ergebnisse nach Der Inspektion kuratierter Online-Hefedatenbanken. Die Genlistentabelle wurde erweitert (gelber Pfeil), um das verbleibende Gen im GRN-Modell von Abbildung 3 zu finden, und Gene wurden abgewählt, um Gene zu entfernen, die nicht im selben GRN-Modell gefunden wurden (roter Pfeil). Die Annotationstabelle wurde basierend auf dem Nachweis der Regulation für jedes auf Yeastract gefundene Gen (grüner Pfeil) ausgefüllt. Die neue Genliste und die Anmerkungsdatei wurden durch Auswahl der entsprechenden Download-Buttons (blaue Pfeile) heruntergeladen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Beispiel für IDP Edge Finding-Ergebnisse im IDV. In den IDV geladen wird das Ergebnisverzeichnis edge finding edge_finding_20210701100152 (Supplemental File 13). (A) Das ursprüngliche Ergebnis, wie es vom IDP erstellt wurde. Die Dropdown-Option Netzwerk von Seed wurde ausgewählt (roter Pfeil), um das vom IDP erzeugte Seed-Netzwerk basierend auf den Argumenten in der verwendeten Konfigurationsdatei (Ergänzende Datei 7) anzuzeigen. Die ausgewählten Gene in der Kantentabelle sind die Kanten, die im Samennetzwerk verwendet werden. (B) Die angepassten Ergebnisse nach Inspektion des Saatgutnetzes auf Kanten, die keine experimentellen Nachweise enthalten. Die Dropdown-Option Netzwerk Aus Auswahl wurde ausgewählt (roter Pfeil). Kanten wurden in der Kantentabelle (grüner Pfeil) an-/abgewählt. Die Seed-Netzwerk-, Edge-Listen- und Knotenlistendateien wurden durch Klicken auf die entsprechenden Schaltflächen (gelbe Pfeile) heruntergeladen. Die angezeigte Kantentabelle enthält zum letzten MalReihendaten, die in der Konfigurationsdatei two_wts_EdgeFinding_config.txt (Ergänzungsdatei 7) aufgeführt sind. Bei der Auswahl von Kanten für das Seed-Netzwerk oder die Edge-Liste auf der Grundlage von LEM-Ergebnissen ist es wichtig, die letzten in der Konfigurationsdatei aufgeführten Zeitreihendaten zu betrachten, da diese Ausgabe alle vorhergehenden Datendateien in ihre Rückschlüsse auf regulatorische Beziehungen zwischen Knoten einbezieht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Example of IDP Network Finding results in the IDV from using the IDP configuration file two_wts_NetFind_rd1_config.txt (Supplemental File 11). (A) Die Abfrage Stable Full Cycle wurde ausgewählt (roter Pfeil), um die entsprechenden Daten auf der y-Achse im Streudiagramm anzuzeigen. Blaue Punkte im Punktdiagramm stellen ausgewählte Punkte dar, die mit der Funktion "Box-Auswahl" für das Punktdiagramm verwendet werden. Das gepunktete Auswahlfeld wurde illustriert, um zu zeigen, wie die Feldauswahl aussieht. (B) Die min- und max-Ganzzahlen für die y-Achse und die x-Achse wurden innerhalb dieser Grenzen manuell in ausgewählte Netzwerke eingegeben (grüner Pfeil). Nach jeder Auswahl wurde auf die Schaltfläche Edge-Prävalenz aus ausgewählten Netzwerken abrufen (gelbe Pfeile) geklickt und die Bereiche Edge-Prävalenztabelle und Ausgewählte DSGRN Predicted Networks generiert. Im Netzwerkindex können Pfeile nach oben und unten angeklickt werden, um die ausgewählten Netzwerke zu durchsuchen (blaue Pfeile). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Beispiel für die IDP-Netzwerksuche führt dazu, dass der IDV die IDP-Konfigurationsdatei two_wts_NetFind_rd2_config.txt verwendet (Ergänzende Datei 12). (A-C) Die Auswahl der Netzwerke erfolgte durch Eingabe von Werten in die Eingabefelder min und max (rote Pfeile). Auf die Schaltfläche Edge-Prävalenz aus ausgewählten Netzwerken abrufen wurde geklickt, um die Bereiche Edge-Prävalenztabelle und Ausgewählte DSGRN-vorhergesagte Netzwerke zu generieren. (D) Interessante Kanten wurden in der Tabelle edge_list (gelber Pfeil) ausgewählt und auf die Schaltfläche Senden (grüner Pfeil) geklickt, um Ähnlichkeitswerte zu berechnen, die im Streudiagramm gegen die ausgewählte Abfrage (blauer Pfeil) dargestellt werden sollen. Die Box Select-Funktion wurde verwendet, um eine Reihe von Netzwerken (violetter Pfeil) auszuwählen, um die Bereiche Edge Prevalence Table und Selected DSGRN Predicted Networks zu generieren. Der Netzwerkindex wurde auf 2 (orangefarbener Pfeil) erhöht, um das zweite Netzwerk in der Auswahl anzuzeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ausdruck	Pipeline-Schritt	Definition
de Lichtenburg von JTK-CYCLE (DLxJTK)	Knotensuche	Ein einziges quantitatives Maß für Periodizität und Regulationsstärke, das zur Einstufung von Genen verwendet wird. Kombiniert die zuvor veröffentlichten Periodizitätsmetriken de Lichtenberg (DL) und JTK-CYCLE (JTK).
Max-Ausdruck des ersten Zyklus	Knotensuche	Die maximale Genexpression während des ersten Zyklus der periodischen Genexpression. Gene, die nach der maximalen Expression des ersten Zyklus geordnet werden, werden basierend auf dem Zeitpunkt aus dem ersten Zyklus geordnet, an dem sie ihre maximale Genexpression erreichen.
Der lokale Edgecomputer (Local Edge Machine, LEM)	Edge-Suche	Eine Bayes'sche Netzwerkinferenzmethode, die potenzielle Modelle von Geninteraktionen bewertet, um die wahrscheinlichsten Regulatoren und Regulationsmodi (Aktivierung oder Repression) eines bestimmten Zielgens unter Verwendung von Zeitreihen-Genexpressionsdaten zu identifizieren.
Seed Netzwerk	Netzwerksuche	Eine erste Vermutung für ein plausibles Netzwerk globaler Interaktionen durch Auswahl der am besten bewerteten LEM-Kanten. Der Seed lokalisiert einen Bereich des Netzwerkraums, der stark oszillatorisch ist und mit hoher Wahrscheinlichkeit Konsistenz mit den bereitgestellten Zeitreihendaten zeigt.
Dynamische Signaturen, die von regulatorischen Netzwerken (DSGRN) generiert werden	Netzwerksuche	Ein Softwarepaket zur umfassenden Berechnung der Vielfalt langfristiger dynamischer Verhaltensweisen, die ein Netzwerk aufweisen kann.
Edge-Prävalenz	Netzwerksuche	Der Prozentsatz der Netzwerke mit der höchsten Punktzahl aus dem Netzwerkfindungsschritt, der den betreffenden Edge enthält. Der Score erlaubt eine Rangfolge von Kanten, die eine Prävalenz ungleich Null aufweisen.

Tabelle 1: Definition der Begriffe Inherent Dynamics Pipeline und Inherent Dynamics Visualizer.

Ergänzende Datei 1: Time series gene expression data (Replicate 1) entnommen aus Orlando, 200813. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 2: Time series gene expression data (Replicate 2) entnommen aus Orlando, 200813. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 3: Anmerkungsdatei, die alle Gene enthält, die in Ergänzungsdatei 1 und Ergänzungsdatei 2 gefunden wurden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 4: Vollständig parametrisierte Konfigurationsdatei für die inhärente Dynamics Pipeline. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 5: Genlistendatei, die von der Seite Node Finding des Inherent Dynamics Visualizer heruntergeladen wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 6: Anmerkungsdatei, die von der Seite Node Finding des Inherent Dynamics Visualizer heruntergeladen wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 7: Inhärente Dynamics Pipeline-Konfigurationsdatei, parametrisiert nur für den Schritt Edge Finding. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 8: Seed-Netzwerkdatei, die von der Seite Edge Finding des Inherent Dynamics Visualizer heruntergeladen wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 9: Edge-Listendatei, die von der Seite Edge-Suche des Inhärenten Dynamics-Visualizers heruntergeladen wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 10: Knotenlistendatei, die von der Seite Edge Finding des Inherent Dynamics Visualizer heruntergeladen wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 11: Inhärente Dynamics Pipeline-Konfigurationsdatei, die nur für den Schritt Netzwerksuche parametrisiert wird. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 12: Aktualisierte Konfigurationsdatei der inhärenten Dynamics Pipeline (Ergänzende Datei 11), die nur für den Schritt Netzwerksuche parametrisiert wurde. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Datei 13: Verzeichnis mit den Ergebnissen aus dem Abschnitt Repräsentative Ergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Die Inferenz von GRNs ist eine wichtige Herausforderung in der Systembiologie. Der IDP generiert Modell-GRNs aus Genexpressionsdaten mit einer Abfolge von Werkzeugen, die die Daten auf immer komplexere Weise nutzen. Jeder Schritt erfordert Entscheidungen darüber, wie die Daten verarbeitet werden sollen und welche Elemente (Gene, funktionelle Interaktionen) an die nächste Schicht des IDP übergeben werden. Die Auswirkungen dieser Entscheidungen auf die Ergebnisse von Binnenvertriebenen sind nicht so offensichtlich. Um dies zu unterstützen, bietet das IDV nützliche interaktive Visualisierungen der Ergebnisse aus einzelnen Schritten der GRN-Inferenzwerkzeuge innerhalb des IDP. Das IDV rationalisiert und erleichtert den Prozess der Bewertung der Ergebnisse dieser rechnerischen Inferenzmethoden, um Experimente zu beschleunigen und Analyseentscheidungen zu treffen, was wiederum die beschleunigte Erstellung von Hochkonfidenz-Netzwerkmodellen und Hypothesen ermöglicht. Das IDV implementiert auch Funktionen, die die Funktionalität des IDP erweitern, einschließlich der Filterung von Kanten nach LEM-ODE-Parameterauswahl, der Bindung von Genen nach ihrer Expressionszeit und der Clustering-Netzwerke basierend auf der Ähnlichkeit mit einem Motiv oder Netzwerk. Wichtig ist, dass das IDV manuelle Eingriffe zwischen den einzelnen IDP-Schritten ermöglicht, wodurch der Benutzer menschliches Wissen und frühere Informationen aus der Literatur auf eine Weise integrieren kann, die nicht einfach automatisiert werden kann. Ein naiver Lauf des IDP wird diese Informationen nicht nativ einbeziehen, so dass die Verwendung des IDV das Vertrauen in die Ergebnisse erhöht, wenn für das Experiment spezifische Informationen verfügbar sind. Insgesamt ermöglicht die Verwendung des IDV in Verbindung mit dem IDP den Benutzern, Netzwerkhypothesen für biologische Prozesse mit größerer Sicherheit zu erstellen, selbst mit wenig oder gar keinem Wissen über die wahre GRN.

Es gibt drei kritische Schritte im IDV. Die erste ist die Auswertung der IDP Node Finding-Ergebnisse im IDV. Die IDV-Seite Node Finding kann eine neue Genliste und, falls gewünscht, eine Genannotationsdatei erstellen. Das Erstellen einer neuen Genliste ist ein kritischer Schritt, da sie den potenziellen Netzwerkraum erheblich reduziert, indem begrenzt wird, welche Gene als GRN-Ziele und / oder Regulatoren modelliert werden dürfen. Da GRNs hauptsächlich aus Transkriptionsfaktoren bestehen, werden Genannotationen bei der Erstellung kohärenter GRN-Modelle sehr hilfreich sein.

Der nächste Schritt ist die Auswertung der IDP Edge Finding-Ergebnisse im IDV. Das Kuratieren eines neuen Seed-Netzwerks ist ein kritischer Schritt, da es den Bereich des Netzwerkraums lokalisiert, der im Schritt Netzwerksuche abgetastet wird. Es ist jedoch nicht immer offensichtlich zu wissen, wo man anfangen soll, daher wird empfohlen, Kanten zu verwenden, die irgendeine Form von experimentellen Beweisen enthalten, um die Gewissheit zu schaffen, dass man in einer Region des Netzwerkraums beginnt, die Kanten mit hoher Zuverlässigkeit enthält. Die Seite Edge Finding des IDV ermöglicht die einfache Zusammenstellung von Seed-Netzwerken und generiert die zugehörige DSGRN-Netzwerkspezifikationsdatei sowie Knoten- und Edge-Listen.

Der letzte Schritt ist die Auswertung der Ergebnisse der IDP-Netzwerkfindung im IDV. Die IDV-Seite Network Finding ermöglicht eine einfache Untersuchung der stichprobenartigen Netzwerke und der zugehörigen Scores, die die Kapazität des Netzwerks zur Erzeugung der beobachteten Dynamik schätzen. Während Node und Edge Finding immer Ergebnisse zurückgeben (wenn mindestens zwei Gene von Node Finding weitergegeben werden), kann Network Finding keine Ergebnisse zurückgeben. Daher ist es bei der Netzwerksuche offensichtlicher zu wissen, ob Anpassungen der Parameter erforderlich sind, als bei der Knoten- und Edgesuche. Solche Vorkommnisse von wenigen bis gar keinen gefundenen Netzwerken könnten das Ergebnis von Einschränkungen sein, die den zu analysierenden Netzwerken auferlegt werden. Diese Einschränkungen sind: 1) ob die Netzwerke immer stark verbunden sind oder nicht, 2) die minimale und maximale Anzahl von Eingabekanten zu jedem Knoten, 3) die Wahrscheinlichkeit des Hinzufügens und Entfernens von Knoten und Kanten und 4) die Anzahl der zulässigen Hinzufügungen und Entfernungen von Knoten und Kanten. Wenn wenige oder keine modellfähigen Netzwerke gefunden werden, wie in Abbildung 2, wird empfohlen, sich auf die IDP-Dokumentation zu beziehen, um die Reparametrisierung einiger oder aller Schritte des IDP mit anschließender Auswertung der Ergebnisse im IDV zu unterstützen.

Eine aktuelle Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass sich die Node Finding-Seite hauptsächlich auf die oszillatorische Dynamik konzentriert, wie sie in den Transkriptionsprogrammen des Zellzyklus und der circadianen Uhr zu sehen ist. Insbesondere der Schritt IDP Node Finding ist derzeit so konfiguriert, dass nach Genen gesucht wird, die zu einem bestimmten Zeitpunkt eine Oszillationsdynamik aufweisen. Wenn sich der IDP um Analysen erweitert, die verschiedene Arten von Transkriptionsdynamik quantifizieren können, wird auch das IDV aktualisiert, um die Visualisierung und Abfrage dieser anderen Verhaltensweisen zu unterstützen. Die Größe der im Schritt Network Finding gesuchten und analysierten Netzwerke ist derzeit auf Netzwerke kleinerer Größe beschränkt, z.B. etwa 10 Gene. Dies ist eine Notwendigkeit, da Berechnungen in der DSGRN-Skala kombinatorisch erfolgen. Eine weitere Einschränkung besteht darin, dass die Untersuchung des Modellparameterraums für ein ausgewähltes Netzwerk im IDV nicht möglich ist. Die DSGRN-Netzwerkspezifikationsdatei für ein bestimmtes Netzwerk kann jedoch heruntergeladen werden, und die mit jedem Modellparameter verknüpfte Dynamik kann auf der DSGRN Visualization-Website (https://sites.math.rutgers.edu/~gameiro/dsgrn_viz/) visualisiert werden. Schließlich wurde der IDV mit Linux ( Ubuntu) und iOS (Big Sur) Systemen getestet. Der IDV wurde unter Windows 10 mit dem Windows-Subsystem für Linux (WSL) getestet, das es Windows 10-Benutzern ermöglicht, Linux und den IDV auszuführen, ohne dass ein anderer Computer, eine virtuelle Maschine oder ein Dual-Boot-Setup erforderlich ist. IDV läuft derzeit nicht unter nativem Windows.

Das Studium von GRNs ist aufgrund ihrer inhärenten Komplexität schwierig und nützliche Inferenzwerkzeuge wie der IDP können schwer zu verstehen und mit Zuversicht einzusetzen sein. Das IDV bietet eine Methode, um die Komplexität der Untersuchung von GRNs, die mit dem IDP abgeleitet wurden, zu reduzieren und gleichzeitig die Einbeziehung zusätzlicher Informationen über die Genexpressionsdynamik hinaus zu erleichtern. Die Verwendung des IDV in Verbindung mit dem IDP, wie hier beschrieben, wird es den Forschern ermöglichen, Funktionsmodelle von gut untersuchten Systemen wie dem menschlichen Zellzyklus zu entwickeln und zu analysieren. Darüber hinaus werden diese Werkzeuge überprüfbare Hypothesen für weniger verstandene Prozesse generieren, wie z.B. den intra-erythrozytischen Entwicklungszyklus von Malaria, der im Verdacht steht, von einem ^GRN24 kontrolliert zu werden, für den jedoch noch kein Modell vorgeschlagen wurde.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Docker			https://docs.docker.com/get-docker/
Git			https://git-scm.com/
Inherent Dynamics Pipeline			https://gitlab.com/biochron/inherent_dynamics_pipeline
Inherent Dynamics Visualizer			https://gitlab.com/bertfordley/inherent_dynamics_visualizer
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html
Pip			https://pip.pypa.io/en/stable/