Summary
Vi beskriver den intraparenkymale transplantation af humane neurale stamceller transduceret med en dobbelt reportervektor, der udtrykker luciferasegrønt fluorescerende protein (GFP) i musehjernen. Efter transplantation måles luciferasesignalet gentagne gange ved hjælp af in vivo-bioluminescens og GFP-ekspressionerende podede celler identificeret i hjernesektioner ved hjælp af fluorescensmikroskopi.
Abstract
Celleterapi har længe været et spirende behandlingsparadigme inden for eksperimentel neurobiologi. Celletransplantationsundersøgelser er imidlertid ofte afhængige af endepunktsmålinger og kan derfor kun evaluere langsgående ændringer i cellemigration og overlevelse i begrænset omfang. Dette papir giver en pålidelig, minimalt invasiv protokol til transplantation og langsgående spor neurale stamceller (NPC'er) i den voksne musehjerne. Før transplantation transduceres celler med en lentiviral vektor bestående af en bioluminescerende (firefly-luciferase) og fluorescerende (grønt fluorescerende protein [GFP]) reporter. NPC'erne transplanteres til højre kortikale halvkugle ved hjælp af stereotaksiske injektioner i den sensorimotoriske cortex. Efter transplantation blev podede celler påvist gennem det intakte kranium i op til fem uger (på dag 0, 3, 14, 21, 35) med en opløsningsgrænse på 6.000 celler ved hjælp af in vivo bioluminescensbilleddannelse. Derefter identificeres de transplanterede celler i histologiske hjernesektioner og karakteriseres yderligere med immunofluorescens. Således giver denne protokol et værdifuldt værktøj til at transplantere, spore, kvantificere og karakterisere celler i musehjernen.
Introduction
Pattedyrshjernen har begrænset regenerativ kapacitet efter skade eller sygdom, hvilket kræver innovative strategier til fremme af væv og funktionel reparation. Prækliniske strategier fokuserer på forskellige aspekter af hjerneregenerering, herunder neurobeskyttelse, neurogenese, angiogenese 1,2, blod-hjerne-barriere reparation 3,4 eller celleterapi 5,6. Celleterapi har den fordel, at den er i stand til at fremme mange af disse pro-reparationsprocesser samtidigt. I forsøg med transplantation af celler er vævsreparation sket gennem (1) direkte celleudskiftning og (2) produktion af cytokiner, der fører til angiogenese og neurogenese7. Nylige fremskridt inden for stamcelleteknologi har yderligere lettet udviklingen af skalerbare, velkarakterielle neurale cellekilder, der nu er i støbeskeen til kliniske forsøg (gennemgået i 7,8,9). Selvom celleterapier har nået det kliniske stadium for nogle få neurologiske sygdomme (f.eks. Parkinsons sygdom10, slagtilfælde11 og rygmarvsskade12), har deres effektivitet været variabel, og mere præklinisk forskning er nødvendig for at forstå mekanismerne for graft-værtsinteraktioner.
En stor begrænsning af mange prækliniske undersøgelser er den kontinuerlige sporing af de transplanterede celler inde i værten. Ofte udføres kun slutpunktsmålinger, idet de dynamiske migrations- og overlevelsesprocesser i værten 6,13 udelades. Disse begrænsninger resulterer i dårlig karakterisering af de podede celler og kræver høje dyretal for at forstå langsgående ændringer. For at overvinde disse begrænsninger transducerer vi i denne undersøgelse induceret pluripotent stamcelle (iPSC)-afledte neurale stamceller med en kommercielt tilgængelig dual-reporter lentiviral vektor bestående af rød firefly luciferase og forbedret grønt fluorescerende protein (rFluc-eGFP). Disse celler transplanteres via stereotaksisk intraparenkymal injektion i musehjernen og spores i længderetningen ved hjælp af in vivo bioluminescensbilleddannelse over 5 uger. Efter indsamling af hjernevæv identificeres de GFP-ekspressionerende podede celler og karakteriseres yderligere i histologiske hjernesektioner. Denne metode kan smidigt tilpasses alternative transducerbare cellekilder og transplantationsveje til in vivo-applikationer i gnaverhjernen. Samlet set er proceduren værdifuld for at opnå langsgående information om graftoverlevelse og migration i musehjernen og letter efterfølgende histologisk karakterisering.
Protocol
BEMÆRK: Alle forsøg med mus blev udført i overensstemmelse med statslige, institutionelle og ARRIVE-retningslinjer og blev godkendt af det kantonale veterinærkontor i Zürich. Voksne mandlige og kvindelige ikke-overvægtige diabetiske SCID gamma (NSG) mus (10-14 uger, 25-35 g) blev anvendt. Mus blev anbragt i almindelige type II/III-bure i grupper på mindst to dyr pr. bur i et fugtigheds- og temperaturkontrolleret rum med en konstant 12/12 timers lys/mørk cyklus. .).
1. Cellekultur og viral transduktion
- Differentier neurale stamceller (NPC'er) fra iPSC'er ved hjælp af små molekylehæmmere som tidligere beskrevet14.
- Kultur NPC'er15 fra passage 2 og fremefter i Neural Stem cell Maintenance Medium (NSMM; Tabel 1) suppleret med små molekyler (tabel 1) i 6-brøndsplader (2 ml medium pr. brønd) belagt med poly-ornithin/laminin521 (pLO/L521). Skift medium dagligt.
BEMÆRK: For at passere NPC'er tilsættes 1 ml celledesociationsreagens pr. brønd (se materialetabellen) og inkuberes ved 37 °C i 1 min., indtil de fleste celler løsnes.- Til belægning inkuberes 150 μL pLO i 1 ml 0,1 M fosfatbufret saltvand (PBS) pr. brønd i 2 timer ved stuetemperatur (RT). Efter tre vaske med PBS inkuberes 10 μg L521 i 1 ml PBS pr. brønd i 2 timer ved RT.
- Til viral transduktion, plade 50.000 celler pr. Brønd i en 24-brønds plade belagt med pLO / L521 og tilsæt færdigpakkede virale vektorer (pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro, LL410PA-1) til hver brønd.
BEMÆRK: De samlede infektiøse enheder (IFU) er >2 × 106 IFU og er nok til at inficere 100.000 celler ved en mangfoldighed af infektion (MOI) på 20. Celletælling er udført med en automatiseret celletæller. Transduktionseffektiviteten afhænger stærkt af den anvendte cellelinje. Arbejde med lentivirus kræver overholdelse af de lokale retningslinjer for biosikkerhedsniveau 2 (BSL-2) produkter. - Inkuber cellerne ved 37 °C i 72 timer, mens de daglige mediumændringer fortsættes.
- Bekræft vellykket transduktion ved at kontrollere cellerne for GFP-ekspression i et fluorescensmikroskop. Indstil mikroskopforstørrelsen til 10x eller 20x, og brug den passende excitation (460-480 nm) og emissionsområde (490-520 nm) til at detektere transducerede GFP-ekspressorceller.
- Kvantificering af forholdet mellem GFP-transduceret og totalceller for at estimere den generelle transduktionseffektivitet.
BEMÆRK: Transduktionshastigheder på 65-95% blev opnået med denne protokol. En transduktionseffekt på >50 % anbefales som et go/no-go-kriterium før transplantation. Hvis 50% transduktionseffekt ikke kan opnås, skal du udføre puromycinselektion eller sortere cellerne ved hjælp af flowcytometri for at øge udbyttet af transducerede celler. - Valgfrit: Frysning af celler
- Spin cellerne ned (300 × g, 5 min) og kassér supernatanten. Resuspend pelleten i 1 ml frysemedium (se materialetabellen), og overfør suspensionen til hætteglas for at opnå 106 celler/hætteglas. Cellerne overføres til frysebokse i 24 timer ved -80 °C og derefter til -150 °C til langtidsopbevaring.
2. Celleforberedelse til transplantation
- Saml et hætteglas med celler fra -150 °C opbevaring og overfør det til laboratoriet. Tæl cellerne ved hjælp af en automatiseret celletæller.
BEMÆRK: Hætteglasset indeholder 1,5-2 × 106 celler. - Overfør hurtigt hætteglasset til et vandbad på 37 °C, indtil der ikke er nogen iskrystaller tilbage (2-3 min).
BEMÆRK: Det er vigtigt at tø hurtigt op for at minimere eventuelle skader på cellemembraner. Hætteglasset må ikke nedsænkes helt i vandbadet, da det kan øge risikoen for kontaminering. - Overfør hætteglasset til biosikkerhedsskabet, og pipetter hele indholdet (~ 1 ml) til et sterilt 15 ml konisk rør.
BEMÆRK: Arbejde med lentiviralt transducerede celler kræver BSL-2. Imidlertid fjerner vaske- og passaging celler virale partikler fra mediet. Oplysninger om, hvornår en overførsel fra BSL-2 til BSL-1 er tilladt, skal indhentes fra de lokale myndigheder. - Tilsæt 9 ml steril 1x PBS og centrifuge i 5 minutter ved 300 × g, RT.
- Fjern supernatanten ved aspiration ved hjælp af en pipette (1-10 ml); Vip forsigtigt suspensionen mod pipettespidsen, og begynd at aspirere. Pas på ikke at forstyrre pelleten.
- Vask cellerne ved at genbruge i 10 ml steril 1x PBS.
BEMÆRK: Tab forsigtigt røret for at suspendere celler igen i restvolumenet. Triturer langsomt cellesuspensionen ved hjælp af en 1 ml pipette, indtil den ikke indeholder klumper eller aggregater. - Tæl cellerne før det endelige spin ved hjælp af en automatiseret celletæller.
- Centrifuge i 5 min ved 300 × g, RT.
- Fjern supernatanten (trin 2.5), og genophæng cellepillen i det krævede volumen steril PBS til en koncentration på 8 × 104 celler / μL. Læg cellerne på is og brug dem til transplantation inden for de næste 5 timer.
BEMÆRK: Et volumen på 1,6 × 105 celler /2 μL PBS blev anvendt i denne protokol.
3. Transplantationsprocedure
- Forberedelse til operation
- Rengør og steriliser operationsudstyret.
- Forbered den stereotaxiske enhed og mikroinjektionspumpesystemet.
BEMÆRK: Det er vigtigt at teste Hamilton-sprøjten og 30 G, 2 tommer nålen inden start. Indsæt nålen i et rør indeholdende steril 0,9% NaCl og træk langsomt opløsningen ind og ud. - Opsæt anæstesimaskinen. Test maskinen, før du involverer dyr. Rengør induktionskammeret med 70% ethanol.
- Forberedelse af dyr
- Hold musene i mindst 7 dage før forsøgene under standardbetingelser for at akklimatisere dem.
BEMÆRK: Følgende dyr blev anvendt til denne protokol: hun NOD/SCID/IL2rγnull (30-35 g, også kendt som NSG) og hun C57BL/6J (20-25 g, også kendt som B6). Proceduren kan også udføres med hanmus. - Mål musens kropsvægt og juster dosis af det smertestillende middel, der skal injiceres. Administrer carprofen (5 mg/kg legemsvægt) intraperitonealt for at reducere smerter og/eller forhindre en inflammatorisk reaktion.
- Anæstesi dyrene ved hjælp af isofluran (3% i induktionsfasen og 1,5-2% i vedligeholdelsesfasen under operationen) fordampet i ilt.
BEMÆRK: Gasformig anæstesi foretrækkes på grund af en hurtig opvågning efter den kirurgiske procedure, og fordi niveauerne af bedøvelsesgas let kan justeres. - Brug nociceptive reflekser for at sikre, at dyret er dybt bedømmet (f.eks. Tåklemme). Når dyb anæstesi er nået, skal du transportere dyret fra induktionskammeret til den stereotaksiske ramme. Oprethold anæstesi ved hjælp af en ansigtsmaske.
BEMÆRK: Åndedrætshastigheden skal overvåges visuelt under hele proceduren (40-60 vejrtrækninger pr. Minut). Brug en opvarmningspude for at undgå hypotermi under proceduren. - Påfør oftalmisk smøremiddel for at forhindre øjnene i at tørre ud.
- Barber musebunden med en elektrisk barbermaskine og desinficer huden med 5% betadinopløsning ved hjælp af vatpinde.
- Fastgør musehovedet og indsæt ørestængerne i den ydre meatus.
BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige trommehinderne. Påfør lidokainsalve på begge øregange, inden du indsætter ørestængerne. For at kontrollere, om dyrets hoved er i en stabil position, skal du forsigtigt skubbe ned på hovedet for at se, om der er bevægelse. Hvis der konstateres bevægelse, er enten ørestangen, næsestykkets placering eller begge dele forkerte og skal justeres igen.
- Hold musene i mindst 7 dage før forsøgene under standardbetingelser for at akklimatisere dem.
- Craniotomi
- Brug et kirurgisk blad til at lave et snit langs midterlinjen, der er stort nok til at afsløre lambda- og bregma-landemærkerne.
BEMÆRK: Hudretraktorer kan påføres for at holde kraniet udsat. - Træk periosteum og fascia tilbage med en skalpel og brug sterile vatpinde til at tørre kraniets overflade.
- Juster øre- og mundstængerne for at standardisere hovedpositionen.
BEMÆRK: De lodrette koordinater for bregma og lambda skal være identiske for anteroposterior positionering. - Placer nålen ved bregma og beregn koordinaterne for de ønskede injektionspunkter (de koordinater af interesse, der er valgt til denne protokol: forreste-bageste (AP): + 0,5 mm, medial-lateral (ML): + 1,5 mm). Flyt nålen til det punkt, og markér den med blæk.
BEMÆRK: Koordinaterne blev valgt ud fra Franklin og Paxinos Mouse Brain Atlas 16. Afstande er mm fra bregma. - Påfør steril 0,9% NaCl på kraniet og bor et hul med en diameter på 2-3 mm gennem kraniet med en kirurgisk, dental boremaskine.
- Flyt nålen til overfladen af dura og beregn dybdekoordinaterne.
- Brug et kirurgisk blad til at lave et snit langs midterlinjen, der er stort nok til at afsløre lambda- og bregma-landemærkerne.
- Transplantation procedure
- Resuspend cellerne i røret (trin 2.9) og træk 2 μL cellesuspension i en sprøjte (5 μL eller 10 μL).
BEMÆRK: Sørg for, at der ikke er luftbobler i cellesuspensionen. Sprøjten skal opbevares vandret, indtil den monteres i den stereotaktiske enhed for at undgå cellesedimentering. - Placer sprøjten over målstedet (beregnede koordinater: AP: + 0,5 mm, ML: + 1,5 mm) og flyt langsomt nålen til overfladen af duraen.
BEMÆRK: Hvis du er i tvivl om de korrekte koordinater, skal du udføre injektioner med et farvestof og histologisk evaluering af injektionsstedet, før du transplanterer celler (for flere detaljer, se 17). - Før nålen med en hastighed på 0,02 mm/s ind i hjernen op til den rette dybde (koordinaten valgt til denne protokol er dorsal-ventral (DV) - 0,8 mm). Overskred dybden med 0,1 mm, og træk nålen ud over samme afstand for at skabe en lomme til de injicerede celler.
- Påfør vævsklæbemiddel omkring nålen ved hjælp af tang for at forhindre lækage af celler.
- 2 μL af den forberedte cellesuspension injiceres med en konstant hastighed på 3-5 nL/s.
BEMÆRK: Injektionsproceduren varer mellem 7 og 12 minutter. - Efter injektion skal du lade nålen være på plads i mindst 5 minutter, før du langsomt trækker den ud. Påfør vævsklæbemiddel for at forsegle hullet i kraniet og vent i yderligere 2 minutter.
- Resuspend cellerne i røret (trin 2.9) og træk 2 μL cellesuspension i en sprøjte (5 μL eller 10 μL).
- Suturer og efterbehandling
- Påfør steril 0,9% NaCl-opløsning på det udsatte kranium for at undgå dehydrering.
- Luk såret op med en 5/0 silke suturtråd.
- Hydrer dyret med 0,5 ml ringerlactatopløsning subkutant injiceret i nedre ryg.
- Afbryd anæstesi levering og fjern forsigtigt musen fra det stereotaksiske apparat og læg den tilbage i et bur, der holdes på en varmepude.
- Overvåg dyrene i den akutte fase efter skade. Kontroller suturen, dyrets vægt og det generelle helbred mindst to gange om dagen.
4. In vivo-billeddannelse
- Fremstilling af luciferin
- Tø D-luciferin kaliumsalt op ved RT og tilbered en frisk stamopløsning af D-luciferin ved 30 mg/ml i PBS.
- Steriliser stamopløsningen gennem et 0,22 μm sprøjtefilter.
BEMÆRK: Øjeblikkelig brug af arbejdsløsningen anbefales. Om nødvendigt kan opløst luciferin opbevares ved -20 °C. Langvarig opbevaring kan dog resultere i nedbrydning af signalet. Luciferin er et lysfølsomt reagens; hold det ude af direkte lys, når det er muligt. Alternative substrater kan også overvejes, f.eks. cycluc, for at forbedre opløsningsgrænsen18.
- Imaging
- Indledende opsætning
BEMÆRK: Bioluminescensbilleddannelse blev udført ved hjælp af et in vivo-billeddannelsessystem (se materialetabellen) bestående af et mørkt kammer og et afkølet ladningskoblet enhedskamera (CCD).- Dobbeltklik på softwareikonet Living Image, og vælg et bruger-id på rullelisten.
- Klik på Initialiser i det kontrolpanel , der vises. Når initialiseringsprocessen er afsluttet, bliver temperaturboksen i kontrolpanelet grøn.
- Markér felterne Selvlysende og Fotografisk i kontrolpanelet, og vælg Automatisk eksponering (~60 s). Vælg et synsfelt (D/12,5 cm blev valgt til denne protokol). Indtast motivhøjden (1,5 cm), og vælg indstillingen Brug fokus på motivhøjde. Indstil manuelt følgende parametre: stor binning, f/2, blokeret excitationsfilter og åbent emissionsfilter.
- Bestem injektionsmængden af D-luciferin ved 300 mg/kg legemsvægt. BEMÆRK: Den anbefalede standarddosis er 150 mg/kg D-luciferin. Denne procedure blev justeret i henhold til en protokol, der rapporterede højere følsomhed ved hjælp af 300 mg/kg18.
- Injicer luciferin intraperitonealt (i.p.).
BEMÆRK: Hvis dyret skal bedøves før injektion, skal du være opmærksom på, at det kan forlænge den maksimale luciferase-ekspressionstid. - Vent i 5 minutter, og bedøm derefter dyr med en kontinuerlig tilførsel af isofluran (4,5% i induktionsfasen og 1,5-2% i vedligeholdelsesfasen under billeddannelsesproceduren).
- Påfør oftalmisk smøremiddel på øjnene, og barber derefter de bedøvede dyr på hovedområdet ved hjælp af en konventionel hårbarbermaskine. Placer dyrene i billedbehandlingskammeret, og start billeddannelsen 15 minutter efter luciferininjektionen ved at klikke på Erhverv i kontrolpanelet .
- Indledende opsætning
5. Perfusion
- Anæstesi dyrene ved en i.p. injektion af natrium pentobarbital (150 mg/kg legemsvægt). Vent, indtil musen ikke længere reagerer på smertefulde stimuli, såsom tåklemme.
- Læg musen på ryggen og brug pincet og saks til at åbne brysthulen.
- Brug standardsaks til at åbne membranen.
- Udsæt hjertet og indsæt en nål (fra slangen med ringe/4% paraformaldehydopløsning (PFA)) i toppen af venstre ventrikel.
BEMÆRK: Pas på at holde spidsen af nålen i ventrikelens lumen. - Skær højre ventrikel ved hjælp af en saks.
- Perfuse med ringeopløsning (kan opbevares ved RT) i 3-4 min (flowhastighed: 17 ml/min). Fortsæt, indtil hjertet er rent.
- Skift stophanen for at muliggøre strømmen af PFA (opbevar ved 4 °C; hold på is under proceduren) og perfus i yderligere 5 minutter (~ 100 ml).
- Stop pumpen og fjern nålen fra venstre ventrikel.
BEMÆRK: Perfusionen med PFA bevarer vævets integritet ensartet. Det letter også bevarelsen af GFP-signal i transplantationerne, der ellers kan gå tabt på grund af diffusion.
6. Behandling
- Vævsopsamling
- Fjern hovedet ved hjælp af standard saks og lav et midterlinjesnit i huden.
- Vend huden over øjnene for at udsætte kraniet.
- Start fra den kaudale del på punktet af parietalbenet og lav et lille snit ved hjælp af fjedersaks. Fremryk saksen rostralt langs den midterste sutur op til et punkt mellem øjnene. Start igen fra den kaudale del og lav to snit parallelt og ~ 4 mm fra hinanden i sagittalplanet.
BEMÆRK: Pas på ikke at beskadige hjernen ved at trykke saksen mod kraniets indre overflade. - Brug tang til forsigtigt at vippe den ene side af parietalbenet og bryde det af. Gør det samme med den anden side.
BEMÆRK: Brug en mikrospatula til at frigøre knoglen fra meninges; Ellers kan de beskadige hjernen, mens de brækker kraniet af. Hvis dele af frontbenet forbliver, skal du lave et lille snit for at vippe og afbryde knoglepladen. - For at frigøre hjernen skal du forsigtigt skubbe mikropatulaen under hjernen (olfaktoriske pærer) og vippe den forsigtigt opad.
- Efter indsamling opbevares hjernen i 4% PFA-opløsning i 4-6 timer ved 4 °C. Overfør det til steril 1x PBS bagefter.
- Immunohistokemi
- Overfør hjernen til en 30% saccharoseopløsning i mindst 48 timer ved 4 °C for at forhindre dannelse af krystaller under frysning.
- Brug et glidende mikrotome til at skære koronale sektioner med en tykkelse på 40 μm. Sektionerne samles og opbevares som fritsvævende sektioner (i en plade med 24 brønde) i en kryoprotektiv opløsning (tabel 1) ved -20 °C indtil videre forarbejdning.
- Skyl sektionerne med 450 μL 1x PBS for hver brønd (3 gange, 5 minutter hver, RT).
- Bloker ikke-specifikke steder med 450 μL blokerende opløsning for hver brønd (tabel 1) i 1 time ved RT.
- Inkuber hver brønd med 450 μL primære antistoffer ved 4 °C natten over. Fortynd antistofferne 1:200 i 3% æselserum; 0,1% Triton-X-100 i PBS. For at identificere donormateriale i værtsmiljøet skal du bruge et antistof mod humane specifikke kerner (Anti-Human Nuclei Antibody, klon 235-1).
- Vask sektionerne med 450 μL 1x PBS for hver brønd (3 gange, 5 min hver, RT).
- Inkuber hver brønd med 450 μL tilsvarende fluorescerende sekundære antistoffer i 2-3 timer (RT). Fortynd antistofferne i 3% æselserum; 0,1% Triton-X-100 i 1x PBS.
- Vask sektionerne med 450 μL 1x PBS for hver brønd (3 gange, 5 min hver, RT).
- Pletter kernerne med 450 μL 0,1 μg/ml 4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI).
Representative Results
Vi sigter mod at spore transplanterede neurale stamceller i musehjernen i længderetningen ved hjælp af in vivo bioluminescensbilleddannelse og identificere de transplanterede celler i efterfølgende histologisk analyse (figur 1A). Derfor transduceres neurale stamceller med en lentiviral vektor bestående af EF1α-rFluc-eGFP. Før transplantationen blev cellerne testet for vellykket transduktion ved ekspression af eGFP in vitro (figur 1B). De vellykkede transducerede celler blev stereotaktisk transplanteret i musehjernen ved de ønskede koordinater (f.eks. I den sensorimotoriske cortex). Efter transplantationen blev musene systematisk injiceret med D-luciferin, substratet for rFluc, og signalintensiteterne af de transplanterede celler blev målt for at bekræfte en vellykket transplantation (figur 1C).
For at evaluere detektionsgrænsen for in vivo-bioluminescensbilleddannelsen blev der transplanteret et interval på 6.000-180.000 celler i musens højre sensorimotoriske cortex (figur 2A). Vi påviste <6.000 celler og et bioluminescenssignal, der var proportionalt med det transplanterede celletal direkte efter transplantationen (figur 2B). Da humane cellekilder er immunogene for immunkompetente mus, blev NOD scid gamma (NSG) immundefekte mus brugt til at observere celletransplantternes langsigtede overlevelse. Langtidsoverlevelse og påvisning af et bioluminescenssignal i op til 5 uger blev bekræftet efter celletransplantation (figur 2C,D). De transplanterede celler blev med succes påvist ex vivo i en efterfølgende histologisk analyse gennem eGFP-reporteren og immunsåbning med anti-humane kerner og anti-humane mitokondrielle antistoffer (figur 2E).
Figur 1: Transplantation af neurale stamceller. (A) Skematisk oversigt over generering og transplantation af rFluc-eGFP NPC'er. (B) Repræsentativt immunfluorescensbillede af transducerede NPC'er (GFP-reporter, grøn) modfarvet med DAPI (blå); skalastænger = 5 μm. (C) In vivo-påvisning af bioluminescenssignal i transplanterede celler; farvebjælke = blå (0, min, intet signal), rød (4 flux, p/s × 105, maks. signal) Forkortelser: NPC'er = neurale stamceller; GFP = grønt fluorescerende protein; rFluc-eGFP = rød ildflue luciferase og forbedret grønt fluorescerende protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; p/s = fotoner/s. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Tidsforløb for transplanterede celler. A) Skematisk visning af cellenumre til transplantation. B) Påvisningsgrænse for transplanterede celler 1 time efter transplantationen. (C, D) Tidsforløb for transplantation (180.000 celler) i op til 35 dage i NSG-mus ; farvebjælke = blå (0, min, intet signal), rød (4 flux, p/s × 105, maks. signal) Data er gennemsnitlige ± SEM (n = 3). E) Repræsentative fluorescensbilleder af histologiske sektioner og transplanterede celler 5 uger efter transplantationen. Skalabjælke = 10 μm. Forkortelser: D = dag efter transplantation; NSG = immundefekt NOD scid gamma; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; GFP = grønt fluorescerende protein; HuNu = Anti-humane kerner antistof, klon 235-1; p/s = fotoner/s. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Regenerering af den skadede hjerne for at muliggøre funktionel genopretning er fortsat en uopfyldt udfordring. Mange innovative prækliniske tilgange har udviklet sig målrettet mod for eksempel immunmodulering19,20, angiogenese 1,21,22,23, blod-hjerne-barriere integritet 2,3,24,25 og celleudskiftning 5,26 . Især i de senere år har cellebaserede terapier vist sig som en lovende behandlingsstrategi for hjernen på grund af store fremskridt inden for stamcelleteknologi og effektive differentieringsprotokoller 15,28. Dette papir giver en værdifuld protokol til transplantation og sporing af neurale celler i musehjernen. Metoden kan anvendes til alle transducerbare cellelinjer til in vivo-applikationer i musehjernen.
Den præsenterede opsætning bruger transplantationer af menneskelig oprindelse i en mus. Disse transplantationer er ikke levedygtige på lang sigt hos immunkompetente vildtypemus på grund af immunogenicitet. Derfor blev immundefekte NSG-mus brugt til at overvinde denne begrænsning. Alternativt kan brugen af musetransplantationer foretrækkes for at overvinde de immunogene aspekter. Hvis transplantation af humane celler er påkrævet, repræsenterer humaniserede musemodeller et nyt alternativ til at reducere sandsynligheden for graftafstødning29.
En kommerciel dual-reporter viral vektor bestående af firefly luciferase og eGFP under EF1α promotor blev brugt til at visualisere transplantationerne. Denne promotor blev valgt for at opnå en høj signalintensitet15. Bortset fra NPC'er har andre celletyper imidlertid vist sig at fremme hjernefunktionen efter skade, herunder pericytter30 og astrocytter31; Afhængigt af den anvendte cellelinje kan andre promotorer derfor være mere egnede til at opnå høje ekspressionsniveauer. Derudover kan brugen af transgene promotorer, såsom CMV, føre til nedregulering, især i langsigtede eksperimenter32. Transduktionseffektiviteten af den lentivirale vektor afhænger stærkt af den anvendte cellelinje og kan variere mellem enkeltforsøg. Derfor skal transduktionseffektiviteten evalueres, inden in vivo-forsøgene påbegyndes, og for at korrigere variationer i transduktionseffektiviteten mellem forsøgene. Hjerneområdet for transplantation påvirker også signalstyrken. Selvom der blev opnået en detektionsgrænse på < 6.000 celler til kortikale transplantationer, kan det kræve flere celler at detektere et signal i dybere hjerneområder, for eksempel striatum eller hippocampus.
Transplantationsvolumener i musehjernen er begrænset til 1-2 μL. Derfor er det vigtigt at identificere et passende cellenummer til forsøgene. Det er tidligere blevet observeret, at stigende celletal fører til nedsat overlevelsesrate, sandsynligvis på grund af begrænset tilgængelighed af næringsstoffer og ilt i transplantationsområdet33. In vivo bioluminescensbilleddannelse giver en relativt lav rumlig opløsning sammenlignet med andre in vivo-billeddannelsesmetoder såsom MR eller CT. Derfor kan korte migrationsveje for podede celler kun pålideligt vurderes i den efterfølgende post-hoc-analyse .
Bioluminescensens absolutte signalstyrke er generelt proportional med det transplanterede celleantal. Signalstyrken kan dog reduceres, hvis transplantater transplanteres i dybere hjernestrukturer, eller hvis signalstyrken er uden for det lineære detektionsspektrum i in vivo-billeddannelsessystemet . I øjeblikket udvikles nye substrater for at sikre mere effektiv penetration over blod-hjerne-barrieren end D-luciferin, herunder cycluc1. Disse substrater kan yderligere forbedre detektionsgrænsen for de podede celler i fremtiden18. Samlet set tillader denne protokol en ligetil, minimalt invasiv procedure til transplantation og observation af transplantater i musehjernen.
Disclosures
Forfatterne har ingen potentielle interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne RR og CT anerkender støtte fra Mäxi Foundation og 3R Competence Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Viral Transduction | |||
| pLL-EF1a-rFLuc-T2A-GFP-mPGK-Puro (Lenti-Labeler virus) | Systembio | LL410VA-1 | |
| Consumables | |||
| Eppendorf microtubes; 1.5 mL | Sigma Aldrich | Z606340 | |
| Falcon Tubes; 15 mL | TPP | 91015 | |
| Microscope cover slips | Product of choice | ||
| Microscope slides | Product of choice | ||
| Sterlie cotton swabs | Product of choice | ||
| Sutures; 5/0 silk with curved needle | B. Braun | G0762482 | |
| Syringe filter; 0.22 µm | TPP | 99722 | |
| Syringe; 1 mL and 0.5 mL | B. Braun | 9166017V | |
| Tissue culture plate (24-well) | TPP | 92024 | |
| Equipment | |||
| Automated cell counter (Vi-CELL XR) | Beckmann Coulter Life Science | 383721 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | |
| Forceps, fine | Fine Science Tools | 11412-11 | |
| Heating pad | Product of choice | ||
| High Speed Brushless Micromotor Kit | Foredom | K.1060-22. | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Specific | 60-1000 | |
| In-Vivo imaging system (IVIS Lumina III with Living Imaging 4.2 software package) | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Isoflurane vaporizer | Provet AG | 330724 | |
| Microinjection Syringe Pump system | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Microliter syringe; 700-Series; Volume: 5-10 µL | Hamilton | 7635-01 | |
| Microtome | Leica | HM430 | |
| NanoFill-33 G-Needle (removable and reusable) | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Needle Holder | Fine Science Tools | 12001-13 | |
| Perfusion pump and tubing | Masterflex | HV-77120-42 | |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Small bonn scissors, straight | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Small spring scissors, straight | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Spatula | Merck | Z243213-2EA | |
| Stereotaxic frame for rodents; motorized | World Precision Instruments | 99401 | |
| Pharmaceuticals and Reagents | |||
| Accutase | Invitrogen | A11105-01 | Proteolytic and collagenolytic; cell dissociation reagent |
| Anti-Human Nuclei Antibody, clone 235-1, Biotin Conjugate | Merck | MAB1281B | |
| B27 – Supplement (50x) | Gibco | 17504-001 | |
| Betadine (11 mg Iod als Povidon-Iod pro 1 ml Lösung) | Mundipharma Medical Company | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Blocking solution (3% donkey serum; 0.1% Triton-X-100 in PBS) | Product of choice; can be homemade | ||
| CHIR99021 (10 mM – 2,500x) | StemMACS | 130-103-926 | |
| Cryoprotectant solution | Product of choice; can be homemade | ||
| DAPI solution (1 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Perkin Elmer | 122799 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-074 | |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A-31570 | |
| Donkey serum | Product of choice | ||
| Esconarcon (Pentobarbitalum natricum 300 mg) | Streuli Pharma AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ethanol; 70% | Product of choice | ||
| FGF Basic recombinant human protein, Animal-origin free | Thermo Fisher Scientific | PHG6015 | |
| Glutamax (100x) | Gibco | A12860-01 | |
| hLif (10 µg/mL – 1,000x) | PeproTech | AF-300-05-25UG | |
| Isoflurane (Isofluran (1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl-difluoromethylether) 99.9%) | Provet AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Laminin-L521 (L-521) | Biolaminin LN | LN521 | |
| Lidocaine ointment (Lidocain: 25 mg , Prilocain: 25 mg) | Aspen Pharma Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Mounting Medium | Product of choice; can be homemade | ||
| N2- Supplement (100x) | Gibco | 75202-001 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Ophtalmic lubricant (Retinol palmitat: 15,000 UI) | Bausch & Lomb Swiss AG | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Paraformaldehyde solution | Product of choice | ||
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Can also be homemade |
| Poly-L-ornithine Solution (pLO) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Rimadyl (Carprofen 50 mg) | Zoetis Schweiz GmbH | All pharmaceuticals were provided by the cantonal pharmacy, Zurich, Switzerland | |
| Ringer lactate | B. Braun | 3570500 | |
| Ringer solution | B. Braun | 3570030 | |
| Saline (0.9% NaCl) | B. Braun | 3570160 | |
| SB431542 (10 mM – 3,333.3x) | StemMACS | 130-106-543 | |
| Tissue Adhesive (Histoacryl) | B. Braun | 1050060 |
References
- Rust, R., et al. Nogo-A targeted therapy promotes vascular repair and functional recovery following stroke. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14270-14279 (2019).
- Rust, R., et al. Anti-Nogo-A antibodies prevent vascular leakage and act as pro-angiogenic factors following stroke. Scientific Reports. 9 (1), 20040 (2019).
- Weber, R. Z., et al. Characterization of the blood brain barrier disruption in the photothrombotic stroke model. Frontiers in Physiology. 11, 58226 (2020).
- Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders. Nature Reviews. Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).
- Wang, Y., et al. 3K3A-APC stimulates post-ischemic neuronal repair by human neural stem cells in mice. Nature Medicine. 22 (9), 1050-1055 (2016).
- Llorente, I. L., et al. Patient-derived glial enriched progenitors repair functional deficits due to white matter stroke and vascular dementia in rodents. Science Translational Medicine. 13 (590), (2021).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized brain cells for stroke patients using pluripotent stem cells. Stroke. 49 (5), 1091-1098 (2018).
- Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 103-115 (2020).
- Galgano, M., et al. Traumatic brain injury: current treatment strategies and future endeavors. Cell Transplantation. 26 (7), 1118-1130 (2017).
- Schweitzer, J. S., et al. Personalized iPSC-derived dopamine progenitor cells for Parkinson's disease. The New England Journal of Medicine. 382 (20), 1926-1932 (2020).
- Muir, K. W., et al. Intracerebral implantation of human neural stem cells and motor recovery after stroke: multicentre prospective single-arm study (PISCES-2). Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 91 (4), 396-401 (2020).
- Kawabori, M., et al. Cell therapy for chronic TBI: interim analysis of the randomized controlled STEMTRA trial. Neurology. 96 (8), 1202-1214 (2021).
- George, P. M., et al. Engineered stem cell mimics to enhance stroke recovery. Biomaterials. 178, 63-72 (2018).
- Sancho-Martinez, I., et al. Establishment of human iPSC-based models for the study and targeting of glioma initiating cells. Nature Communications. 7 (1), 1-14 (2016).
- Rust, R., et al. Xeno-free induced pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells for in vivo applications. bioRxiv. , (2022).
- Franklin, K., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's the Mouse brain in stereotaxic coordinates, compact: The coronal plates and diagrams. , Academic Press. (2019).
- Baker, S., Götz, J. A local insult of okadaic acid in wild-type mice induces tau phosphorylation and protein aggregation in anatomically distinct brain regions. Acta Neuropathologica Communications. 4, 32 (2016).
- Cao, J., et al. In vivo optical imaging of myelination events in a myelin basic protein promoter-driven luciferase transgenic mouse model. ASN Neuro. 10, (2018).
- Aswendt, M., Adamczak, J., Couillard-Despres, S., Hoehn, M. Boosting bioluminescence neuroimaging: an optimized protocol for brain studies. PLoS One. 8 (2), 55662 (2013).
- Roth, S., et al. Brain-released alarmins and stress response synergize in accelerating atherosclerosis progression after stroke. Science Translational Medicine. 10 (432), (2018).
- Rust, R., Hofer, A. -S., Schwab, M. E. Stroke promotes systemic endothelial inflammation and atherosclerosis. Trends in Molecular Medicine. 24 (7), 593-595 (2018).
- Rust, R., Gantner, C., Schwab, M. E. Pro- and antiangiogenic therapies: current status and clinical implications. FASEB Journal. 33 (1), 34-48 (2018).
- Rust, R., Grönnert, L., Weber, R. Z., Mulders, G., Schwab, M. E. Refueling the ischemic CNS: guidance molecules for vascular repair. Trends in Neurosciences. 42 (9), 644-656 (2019).
- Nih, L. R., Gojgini, S., Carmichael, S. T., Segura, T. Dual-function injectable angiogenic biomaterial for the repair of brain tissue following stroke. Nature Materials. 17 (7), 642 (2018).
- Montagne, A., et al. Pericyte degeneration causes white matter dysfunction in the mouse central nervous system. Nature Medicine. 24 (3), 326-337 (2018).
- Montagne, A., et al. APOE4 leads to blood-brain barrier dysfunction predicting cognitive decline. Nature. 581 (7806), 71-76 (2020).
- George, P. M., Steinberg, G. K. Novel stroke therapeutics: unraveling stroke pathophysiology and its impact on clinical treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
- Weber, R. Z., et al. Deep learning based behavioral profiling of rodent stroke recovery. bioRxiv. , (2021).
- Nair, R. R., et al. Uses for humanised mouse models in precision medicine for neurodegenerative disease. Mammalian Genome. 30 (7), 173-191 (2019).
- Kirabali, T., Rust, R. iPS-derived pericytes for neurovascular regeneration. European Journal of Clinical Investigation. 51 (9), 13601 (2021).
- Weber, R. Z., Perron, P., Rust, R. Astrocytes for brain repair: More than just a neuron's sidekick. Brain Pathology. 31 (5), Zurich, Switzerland. 12999 (2021).
- Johansen, J., et al. Evaluation of Tet-on system to avoid transgene down-regulation in ex vivo gene transfer to the CNS. Gene Therapy. 9 (19), 1291-1301 (2002).
- Vogel, S., et al. Initial graft size and not the innate immune response limit survival of engrafted neural stem cells. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 784-793 (2018).
