Denne protokol optimerer leveren in situ perfusion / decellularisering og to-foton mikroskopi metoder til at etablere en pålidelig platform til at visualisere dynamikken i ekstracellulær matrix (ECM) remodellering under ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH).
Ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH) er den mest almindelige kroniske leversygdom i USA, der rammer mere end 70 millioner amerikanere. NASH kan udvikle sig til fibrose og til sidst til skrumpelever, en betydelig risikofaktor for hepatocellulært karcinom. Den ekstracellulære matrix (ECM) giver strukturel støtte og opretholder leverhomeostase via matricellulære signaler. Leverfibrose skyldes en ubalance i den dynamiske ECM-remodelleringsproces og er kendetegnet ved overdreven ophobning af strukturelle elementer og tilhørende ændringer i glycosaminoglycaner. Det typiske fibrosemønster af NASH kaldes “kyllingetråd”, som normalt består af zone 3 perisinusformet / pericellulær fibrose, baseret på træk observeret af Massons trikrome plet og Picrosirius røde pletter. Imidlertid kan disse traditionelle tynde todimensionelle (2D) vævsdiasbaserede billeddannelsesteknikker ikke demonstrere de detaljerede tredimensionelle (3D) ECM-strukturelle ændringer, hvilket begrænser forståelsen af den dynamiske ECM-remodellering i leverfibrose.
Det nuværende arbejde optimerede en hurtig og effektiv protokol til at afbilde den oprindelige ECM-struktur i leveren via decellularisering for at løse ovenstående udfordringer. Mus blev fodret enten med chow eller fastfood kost i 14 uger. Decellularisering blev udført efter in situ portalveneperfusion, og to-fotonmikroskopiteknikkerne blev anvendt til at afbilde og analysere ændringer i den oprindelige ECM. 3D-billederne af normal- og NASH-leveren blev rekonstitueret og analyseret. Udførelse af in situ perfusionsdecellularisering og analyse af stilladset ved to-fotonmikroskopi gav en praktisk og pålidelig platform til at visualisere den dynamiske ECM-remodellering i leveren.
Ikke-alkoholisk fedtleversygdom (NAFLD) er den mest almindelige leversygdom, der rammer 20% -25% af den voksne befolkning. 25% af NAFLD-patienterne udvikler sig til ikke-alkoholisk steatohepatitis (NASH), hvor risikoen for skrumpelever, leversvigt og hepatocellulært karcinom øges1. I de næste 20 år anslås det, at NASH vil tegne sig for 2 millioner leverrelaterede dødsfald i US2. Da der ikke er nogen godkendte behandlinger, er der et presserende behov for at dechifrere de mekanismer, der forårsager leverfibrose hos NASH-patienter og udvikle målrettet behandling3.
Den ekstracellulære matrix (ECM) er et dynamisk, komplekst mikromiljø, der udøver tovejskommunikation med celler for at regulere vævshomeostase4. Lever-ECM består af strukturelle elementer såsom proteoglycaner, kollagener, fibronectin, elastin og andre ikke-strukturelle proteiner (fx olfactomedin og thrombospondin) for at yde fysisk og strukturel støtte4.
Leverfibrose er et kronisk sårhelende respons på leverskader af forskellige ætiologier, herunder NASH3. Det skyldes en ubalance i den dynamiske ECM-matrixremodelleringsproces og er kendetegnet ved overdreven strukturelle proteiner i den skadede lever4. Fibrogenese afhænger af den dynamiske celle-celle kommunikation mellem forskellige hepatiske celletyper. Hepatiske stellatceller (HSC’er), når de aktiveres, differentieres til Smooth Muscle Alpha 2 Actin-udtrykkende, migrerende og prolifererende myofibroblastlignende celler og syntetiserer ECM-proteiner som en sårlukkende handling. Aktiverede HSC’er er de centrale kollagenproducerende celler i leveren1.
Den molekylære mekanisme for ECM-remodellering, fibrosemønstre og deres forhold til cellulære begivenheder er ikke klare. En bedre forståelse af den tredimensionelle (3D) ECM-struktur er stadig nødvendig, selvom massespektrometriteknikker har hjulpet med at analysere ECM-proteinsammensætning4. Traditionelt er Massons trikrome plet, Picro Sirius Red pletter og anden harmonisk generation (SHG) billeddannelse blevet udført på todimensionelle (2D) tynde leversektioner. Det typiske fibrosemønster af NASH kaldes “kyllingetråd”, som strækker sig til zone 3 og er perisinusformet / pericellulær fibrose 5,6. Der har imidlertid været mangel på undersøgelser med fokus på 3D-strukturen i den indfødte lever, især dem, der ikke involverer vævssektionering. Robuste billeddannelsesmetoder til at identificere mønstre og karakteristika ved fibrose gennem dynamisk ECM-remodellering i leverfibrose ville betydeligt styrke forståelsen af NASH-mekanismer og identificere nye terapeutiske mål.
For at løse disse udfordringer blev en hurtig og effektiv protokol optimeret til at afbilde den indfødte lever-ECM via decellularisering7. Helleverdecellularisering er en tilgang til at fjerne levercellulært indhold, samtidig med at det oprindelige 3D ECM-netværk opretholdes gennem vaskemiddelperfusion. Mus blev fodret med enten chow eller fastfood diæt (FFD) i 14 uger. Decellularisering blev udført efter in situ portalveneperfusion med mildt rengøringsmiddel og lave strømningshastigheder for at bevare triple-spiralformede og native fibrillære kollagenstrukturer. To-fotonmikroskopi blev anvendt til at analysere ændringer i kollagenstrukturer i ECM. 3D-billederne af den oprindelige ECM-struktur i normale og NASH-lever blev rekonstitueret og analyseret. Udførelse af in situ perfusionsdecellularisering og analyse af stilladset ved to-fotonmikroskopi giver en praktisk og overkommelig platform til at visualisere den dynamiske ECM-ombygning i leveren.
Den nuværende protokol viser, at decellularisering gennem en lav strømningshastighed DOC in situ perfusion bevarer de frangible triple-helical og native fibrillære kollagenstrukturer, hvilket giver en pålidelig og omkostningseffektiv platform til at fange dynamisk ECM-remodellering i NASH leverfibrose. Selvom decellularisering blev udført i normale og fibrotiske lever, før ECM-komponenter blev identificeret eller genereret biologiske stilladser til cellekultur, er dynamikken i ECM-remodellering i leverfibr…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Hyesuk Park for den tekniske hjælp. Denne forskning blev støttet af midler fra National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, til NJT), National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, til NJT). Vi anerkender taknemmeligt Jon Mulholland og Kitty Lee fra Cell Sciences Imaging Facility i Beckman Center for teknisk assistance med to-fotonmikroskopi-billeddannelsen.
4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |