गैर-अल्कोहलिक स्टीटोहेपेटाइटिस के माउस मॉडल में लिवर एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स की 3 डी इमेजिंग
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल गैर-अल्कोहल स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएसएच) के दौरान बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) रीमॉडेलिंग की गतिशीलता की कल्पना करने के लिए एक विश्वसनीय मंच स्थापित करने के लिए सीटू छिड़काव / डीसेल्युलराइजेशन और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी विधियों में यकृत का अनुकूलन करता है।
Abstract
गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएसएच) संयुक्त राज्य अमेरिका में सबसे आम पुरानी जिगर की बीमारी है, जो 70 मिलियन से अधिक अमेरिकियों को प्रभावित करती है। एनएएसएच फाइब्रोसिस और अंततः सिरोसिस में प्रगति कर सकता है, जो हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा के लिए एक महत्वपूर्ण जोखिम कारक है। बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) संरचनात्मक सहायता प्रदान करता है और मातृकोशिकीय संकेतों के माध्यम से यकृत होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है। लिवर फाइब्रोसिस गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग प्रक्रिया में असंतुलन के परिणामस्वरूप होता है और संरचनात्मक तत्वों के अत्यधिक संचय और ग्लाइकोसामिनोग्लाइकेन्स में संबंधित परिवर्तनों की विशेषता है। एनएएसएच के विशिष्ट फाइब्रोसिस पैटर्न को “चिकन तार” कहा जाता है, जिसमें आमतौर पर मैसन के ट्राइक्रोम दाग और पिकरोसिरियस रेड दाग द्वारा देखी गई विशेषताओं के आधार पर ज़ोन 3 पेरिसिनसॉइडल / पेरीसेलुलर फाइब्रोसिस होता है। हालांकि, ये पारंपरिक पतली दो-आयामी (2 डी) ऊतक स्लाइड-आधारित इमेजिंग तकनीक विस्तृत त्रि-आयामी (3 डी) ईसीएम संरचनात्मक परिवर्तनों का प्रदर्शन नहीं कर सकती है, जिससे यकृत फाइब्रोसिस में गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग की समझ सीमित हो जाती है।
वर्तमान कार्य ने उपरोक्त चुनौतियों का समाधान करने के लिए डीसेल्यूलराइजेशन के माध्यम से यकृत में देशी ईसीएम संरचना की छवि बनाने के लिए एक तेज और कुशल प्रोटोकॉल का अनुकूलन किया। चूहों को 14 सप्ताह के लिए चाउ या फास्ट-फूड आहार के साथ खिलाया गया था। सीटू पोर्टल नस छिड़काव के बाद डीसेल्युलराइजेशन किया गया था, और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी तकनीकों को देशी ईसीएम में परिवर्तनों की छवि और विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया था। सामान्य और एनएएसएच लिवर की 3 डी छवियों का पुनर्गठन और विश्लेषण किया गया था। सीटू छिड़काव डीसेलुलराइजेशन में प्रदर्शन करना और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मचान का विश्लेषण करना यकृत में गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग की कल्पना करने के लिए एक व्यावहारिक और विश्वसनीय मंच प्रदान करता है।
Introduction
गैर-अल्कोहल फैटी लीवर रोग (एनएएफएलडी) सबसे आम यकृत रोग है, जो वयस्क आबादी के 20% -25% को प्रभावित करता है। एनएएफएलडी रोगियों का 25% गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएसएच) में प्रगतिकरता है, जहां सिरोसिस, यकृत की विफलता और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा का खतरा बढ़ जाता है। अगले 20 वर्षों में, यह अनुमानलगाया गया है कि एनएएसएच अमेरिका 2 में 2 मिलियन यकृत से संबंधित मौतों के लिए जिम्मेदार होगा। चूंकि कोई अनुमोदित उपचार नहीं हैं, इसलिए एनएएसएच रोगियों में यकृत फाइब्रोसिस का कारण बनने वाले तंत्र को समझने और लक्षित उपचार विकसित करने की तत्काल आवश्यकताहै।
बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) एक गतिशील, जटिल माइक्रोएन्वायरमेंट है जो ऊतक होमियोस्टेसिसको विनियमित करने के लिए कोशिकाओं के साथ द्वि-दिशात्मक संचार करता है। यकृत ईसीएम संरचनात्मक तत्वों जैसे प्रोटिओग्लाइकेन्स, कोलेजन, फाइब्रोनेक्टिन, इलास्टिन और अन्य गैर-संरचनात्मक प्रोटीन (जैसे, ओल्फैक्टोमेडिन और थ्रोम्बोस्पोंडिन) से बना है जो शारीरिक औरसंरचनात्मक सहायता प्रदान करता है।
लिवर फाइब्रोसिस एनएएसएच3 सहित विभिन्न ईटियोलॉजी के यकृत क्षति के लिए एक पुरानी घाव-उपचार प्रतिक्रिया है। यह गतिशील ईसीएम मैट्रिक्स रीमॉडेलिंग प्रक्रिया में असंतुलन के परिणामस्वरूप होता है और घायल यकृत4 में अत्यधिक संरचनात्मक प्रोटीन की विशेषता है। फाइब्रोजेनेसिस विभिन्न यकृत कोशिका प्रकारों के बीच गतिशील सेल-सेल संचार पर निर्भर करता है। हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाएं (एचएससी), सक्रिय होने पर, चिकनी मांसपेशी अल्फा 2 एक्टिन-अभिव्यक्ति, माइग्रेटिंग और मायोफाइब्रोब्लास्ट जैसी कोशिकाओं के प्रसार में अंतर करती हैं और घाव-बंद करने वाली कार्रवाई के रूप में ईसीएम प्रोटीन को संश्लेषित करती हैं। सक्रिय एचएससी यकृत में केंद्रीय कोलेजन उत्पादक कोशिकाएं हैं।
ईसीएम रीमॉडेलिंग का आणविक तंत्र, फाइब्रोसिस के पैटर्न, और सेलुलर घटनाओं के साथ उनका संबंध स्पष्ट नहीं है। त्रि-आयामी (3 डी) ईसीएम संरचना की बेहतर समझ अभी भी आवश्यक है, भले ही मास स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीकों ने ईसीएम प्रोटीन संरचना 4 का विश्लेषण करने में मदद कीहै। परंपरागत रूप से, मैसन के ट्राइक्रोम दाग, पिकरो सिरियस रेड दाग, और दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) इमेजिंग को दो-आयामी (2 डी) पतले यकृत वर्गों पर किया गया है। एनएएसएच के विशिष्ट फाइब्रोसिस पैटर्न को “चिकन तार” कहा जाता है, जो ज़ोन 3 तक फैला हुआ है और पेरिसिनसॉइडल / पेरीसेलुलर फाइब्रोसिस 5,6 है। हालांकि, देशी यकृत की 3 डी संरचना पर ध्यान केंद्रित करने वाले अध्ययनों की कमी रही है, विशेष रूप से वे जिनमें ऊतक अनुभागन शामिल नहीं है। यकृत फाइब्रोसिस में गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग के दौरान फाइब्रोसिस के पैटर्न और विशेषताओं की पहचान करने के लिए मजबूत इमेजिंग दृष्टिकोण एनएएसएच तंत्र की समझ को काफी मजबूत करेगा और नए चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करेगा।
इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, डीसेलुलराइजेशन7 के माध्यम से देशी यकृत ईसीएम की छवि बनाने के लिए एक तेज़ और कुशल प्रोटोकॉल अनुकूलित किया गया था। डिटर्जेंट छिड़काव के माध्यम से देशी 3 डी ईसीएम नेटवर्क को बनाए रखते हुए यकृत सेलुलर सामग्री को हटाने के लिए पूरे-यकृत डीसेल्युलराइजेशन एक दृष्टिकोण है। चूहों को 14 सप्ताह के लिए या तो चाउ या फास्ट-फूड आहार (एफएफडी) खिलाया गया था। ट्रिपल-हेलिकल और देशी फाइब्रिलर कोलेजन संरचनाओं को संरक्षित करने के लिए हल्के डिटर्जेंट और कम प्रवाह दर के साथ सीटू पोर्टल नस छिड़काव के बाद डीसेल्युलराइजेशन किया गया था। ईसीएम में कोलेजन संरचनाओं में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी लागू किया गया था। सामान्य और एनएएसएच लिवर में देशी ईसीएम संरचना की 3 डी छवियों का पुनर्गठन और विश्लेषण किया गया था। सीटू छिड़काव डीसेल्यूलराइजेशन में प्रदर्शन करना और दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा मचान का विश्लेषण करना यकृत में गतिशील ईसीएम रीमॉडेलिंग की कल्पना करने के लिए एक व्यावहारिक और किफायती मंच प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल से पता चलता है कि सीटू छिड़काव में कम प्रवाह दर डीओसी के माध्यम से डीसेल्युलराइजेशन फ्रैंबल ट्रिपल-हेलिकल और देशी फाइब्रिलर कोलेजन संरचनाओं को संरक्षित करता है, जो एनएएसएच लिवर …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम तकनीकी मदद के लिए हेसुक पार्क को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (एनआईडीडीके), एनआईएच (आर01 2डीके083283, एनजेटी), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (एनआईए), एनआईएच (1आर01एजी060726, एनजेटी) से वित्त पोषण द्वारा समर्थित किया गया था। हम दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के साथ तकनीकी सहायता के लिए बेकमैन सेंटर में सेल साइंसेज इमेजिंग सुविधा के जॉन मुलहोलैंड और किट्टी ली को कृतज्ञतापूर्वक स्वीकार करते हैं।
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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