3D-avbildning av leverns extracellulära matris i en musmodell av alkoholfri steatohepatit
Summary
Det nuvarande protokollet optimerar leverns in situ-perfusion /decellularisering och tvåfotonmikroskopimetoder för att etablera en tillförlitlig plattform för att visualisera dynamiken i extracellulär matris (ECM) remodellering under alkoholfri steatohepatit (NASH).
Abstract
Icke-alkoholisk steatohepatit (NASH) är den vanligaste kroniska leversjukdomen i USA och påverkar mer än 70 miljoner amerikaner. NASH kan utvecklas till fibros och så småningom till cirros, en signifikant riskfaktor för hepatocellulärt karcinom. Den extracellulära matrisen (ECM) ger strukturellt stöd och upprätthåller leverhomeostas via matricellulära signaler. Leverfibros är resultatet av en obalans i den dynamiska ECM-remodelleringsprocessen och kännetecknas av överdriven ackumulering av strukturella element och associerade förändringar i glykosaminoglykaner. Det typiska fibrosmönstret för NASH kallas “kycklingtråd”, som vanligtvis består av zon 3 perisinusformad / pericellulär fibros, baserat på funktioner som observerats av Massons trikroma fläck och Picrosirius röda fläckar. Dessa traditionella tunna tvådimensionella (2D) vävnadsglidbaserade avbildningstekniker kan emellertid inte visa de detaljerade tredimensionella (3D) ECM-strukturella förändringarna, vilket begränsar förståelsen för den dynamiska ECM-ombyggnaden vid leverfibros.
Det nuvarande arbetet optimerade ett snabbt och effektivt protokoll för att avbilda den ursprungliga ECM-strukturen i levern via decellularisering för att ta itu med ovanstående utmaningar. Möss matades antingen med chow eller snabbmat diet i 14 veckor. Decellularisering utfördes efter in situ portalvenperfusion, och tvåfotonmikroskopiteknikerna tillämpades för att avbilda och analysera förändringar i den ursprungliga ECM. 3D-bilderna av normal- och NASH-lever rekonstituerades och analyserades. Att utföra in situ perfusionsdecellularisering och analysera ställningen med tvåfotonmikroskopi gav en praktisk och pålitlig plattform för att visualisera den dynamiska ECM-ombyggnaden i levern.
Introduction
Icke-alkoholhaltig fettleversjukdom (NAFLD) är den vanligaste leversjukdomen och drabbar 20% -25% av den vuxna befolkningen. 25% av NAFLD-patienterna utvecklas till alkoholfri steatohepatit (NASH), där risken för cirros, leversvikt och hepatocellulärt karcinom ökar1. Under de kommande 20 åren beräknas NASH stå för 2 miljoner leverrelaterade dödsfall i USA2. Eftersom det inte finns några godkända behandlingar finns det ett akut behov av att dechiffrera de mekanismer som orsakar leverfibros hos NASH-patienter och utveckla riktad behandling3.
Den extracellulära matrisen (ECM) är en dynamisk, komplex mikromiljö som utövar dubbelriktad kommunikation med celler för att reglera vävnadshomeostas4. Leverns ECM består av strukturella element såsom proteoglykaner, kollagener, fibronektin, elastin och andra icke-strukturella proteiner (t.ex. olfactomedin och trombospondin) för att ge fysiskt och strukturellt stöd4.
Leverfibros är ett kroniskt sårläkningssvar på leverskador av olika etiologier, inklusive NASH3. Det beror på en obalans i den dynamiska ECM-matrisremodelleringsprocessen och kännetecknas av överdrivna strukturella proteiner i den skadade levern4. Fibrogenes beror på den dynamiska cell-cellkommunikationen mellan olika levercelltyper. Hepatiska stellatceller (HSC), när de aktiveras, differentieras till glatt muskulatur alfa 2 Actin-uttryckande, migrerande och prolifererande myofibroblastliknande celler och syntetiserar ECM-proteiner som en sårstängande verkan. Aktiverade HSC är de centrala kollagenproducerande cellerna i levern1.
Den molekylära mekanismen för ECM-remodellering, fibrosmönster och deras förhållande till cellulära händelser är inte klarlagda. En bättre förståelse av den tredimensionella (3D) ECM-strukturen behövs fortfarande, även om masspektrometritekniker har hjälpt till att analysera ECM-proteinsammansättning4. Traditionellt har Massons trikroma fläck, Picro Sirius Red-fläckar och andra harmoniska generationens (SHG) avbildning utförts på tvådimensionella (2D) tunna leversektioner. Det typiska fibrosmönstret för NASH kallas “kycklingtråd”, som sträcker sig till zon 3 och är perisinusformad / pericellulär fibros 5,6. Det har dock saknats studier som fokuserar på 3D-strukturen hos den inhemska levern, särskilt de som inte involverar vävnadssnitt. Robusta avbildningsmetoder för att identifiera mönster och egenskaper hos fibros under dynamisk ECM-remodellering vid leverfibros skulle avsevärt stärka förståelsen för NASH-mekanismer och identifiera nya terapeutiska mål.
För att ta itu med dessa utmaningar optimerades ett snabbt och effektivt protokoll för att avbilda den ursprungliga lever-ECM via decellularisering7. Helleverdecellularisering är ett tillvägagångssätt för att avlägsna det hepatiska cellulära innehållet samtidigt som det ursprungliga 3D ECM-nätverket upprätthålls genom tvättmedelsperfusion. Möss matades antingen chow eller snabbmatdiet (FFD) i 14 veckor. Decellularisering utfördes efter in situ portalvenperfusion med milt rengöringsmedel och låga flödeshastigheter för att bevara trippelspiralformade och inhemska fibrillära kollagenstrukturer. Tvåfotonmikroskopi användes för att analysera förändringar i kollagenstrukturer i ECM. 3D-bilderna av den ursprungliga ECM-strukturen i normala och NASH-lever rekonstituerades och analyserades. Att utföra in situ perfusionsdecellularisering och analysera ställningen med tvåfotonmikroskopi ger en praktisk och prisvärd plattform för att visualisera den dynamiska ECM-ombyggnaden i levern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det nuvarande protokollet visar att decellularisering genom en låg flödeshastighet DOC in situ perfusion bevarar de frangible trippelspiralformade och inhemska fibrillära kollagenstrukturerna, vilket ger en pålitlig och kostnadseffektiv plattform för att fånga dynamisk ECM-remodellering i NASH-leverfibros. Även om decellularisering utfördes i normala och fibrotiska lever innan ECM-komponenter identifierades eller biologiska byggnadsställningar genererades för cellodling, har dynamiken i ECM-remodelleri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Hyesuk Park för den tekniska hjälpen. Denna forskning stöddes av finansiering från National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, till NJT), National Institute on Aging (NIA), NIH (1R01AG060726, till NJT). Vi tackar Jon Mulholland och Kitty Lee från Cell Sciences Imaging Facility i Beckman Center för teknisk hjälp med tvåfotonmikroskopiavbildning.
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
References
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
- Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
- Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome – looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).
- Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
- Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
- Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83 (2019).
- Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398 (2016).
- Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
- Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).
- Cox, T. R. The matrix in cancer. Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).
- Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).
- Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).
