JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Kornea Yara İyileşmesini İncelemek İçin Epitelyal Aşınma Modeli

Published: December 29, 2021
doi:
10.3791/63112
, , , ,
1College of Optometry,University of Houston, 2Children’s Nutrition Research Center,Baylor College of Medicine, 3Center for Translational Research on Inflammatory Diseases (CTRID),Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center

Summary

Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu kornea yara iyileşmesi modeli yüksek oranda tekrarlanabilir ve şimdi hastalıklar bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır.

Abstract

Kornea görme için kritik öneme sahiptir ve gözün kırılma gücünün yaklaşık üçte ikisini oluşturur. Korneanın vizyondaki rolü için çok önemli olan şey şeffaflığıdır. Bununla birlikte, dış pozisyonu nedeniyle, kornea, kornea şeffaflığının kaybına ve nihai körlüğe yol açabilecek çok çeşitli yaralanmalara karşı oldukça hassastır. Bu yaralanmalara yanıt olarak etkili kornea yarasının iyileşmesi, kornea homeostazının korunmasında ve kornea saydamlığının ve kırma yeteneklerinin korunmasında çok önemlidir. Tehlikeye giren kornea yarası iyileşmesi durumunda, kornea enfeksiyonlara, ülserasyonlara ve yara izlerine karşı savunmasız hale gelir. Kornea yaralanması iyileşmesinin kornea şeffaflığının ve görmenin korunmasındaki temel önemi göz önüne alındığında, normal kornea yarası iyileşme sürecinin daha iyi anlaşılması, enfeksiyon ve hastalıkla ilişkili bozulmuş kornea yarasının iyileşmesini anlamak için bir ön koşuldur. Bu amaç doğrultusunda, kornea yaralanmasının murin modellerinin, normal fizyolojik koşullar altında çalışan kornea yarası iyileşme mekanizmalarını daha iyi anlamamızda yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitel aşınması oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu modelde, yara bölgesini ayırmak için kornea üzerinde ortalanmış 2 mm çapında dairesel bir trefin kullanılır. Golf sıçrayışı, epiteli debride etmek ve kornea epitel bazal membranına zarar vermeden dairesel bir yara oluşturmak için özenle kullanılır. Ortaya çıkan enflamatuar yanıt, etkili yara iyileşmesi için kritik olan iyi karakterize edilmiş hücresel ve moleküler olayların bir kaskadı olarak ilerler. Bu basit kornea yara iyileşmesi modeli oldukça tekrarlanabilir ve iyi yayınlanmıştır ve şimdi hastalık bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır.

Introduction

Kornea gözün üçte birinin saydam ön kısmıdır. Kornea gözün iç yapılarını korumak ve gözü enfeksiyonlara karşı koruyan yapısal bir bariyer oluşturmak da dahil olmak üzere çeşitli işlevlere hizmet eder1. Daha da önemlisi, kornea görme için kritik öneme sahiptir ve gözün kırılma gücünün yaklaşık üçte ikisini sağlar 2,3. Korneanın vizyondaki rolü için çok önemli olan şey şeffaflığıdır. Bununla birlikte, dışa doğru pozisyonu nedeniyle, kornea günlük olarak bariyer fonksiyonunun bozulmasına, şeffaflık kaybına ve nihai körlüğe yol açabilecek çok çeşitli yaralanmalara maruz kalmaktadır. Kornea saydamlık kaybı tüm dünyada görme bozukluğunun önde gelen nedenlerinden biridir 4,5. Kornea sıyrıkları, acil servise (ER) yapılan ziyaretlerin yaygın bir nedenidir ve ER6’da sunulan gözle ilgili vakaların yarısını oluşturur. Amerika Birleşik Devletleri’nde yılda 1 milyondan fazla kişinin gözle ilgili yaralanmalardan muzdarip olduğu tahmin edilmektedir7. Bu yaralanmalara yanıt olarak etkili kornea yarasının iyileşmesi, kornea homeostazının korunması, şeffaflığının ve kırma yeteneklerinin korunması için çok önemlidir. Tehlikeye giren kornea yarasının iyileşmesi durumunda, kornea enfeksiyonlara, ülserasyonlara ve yara izlerine karşı savunmasız hale gelir 8,9. Ayrıca, refraktif ameliyatların artan popülaritesi, kornea10’a benzersiz bir travmatik zorluk getirmektedir. Kornea yaralanması iyileşmesinin kornea şeffaflığının ve görmenin korunmasındaki temel önemi göz önüne alındığında, normal kornea yarası iyileşme sürecinin daha iyi anlaşılması, enfeksiyon ve hastalıkla ilişkili bozulmuş kornea yarasının iyileşmesini anlamak için bir ön koşuldur.

Bu amaçla, kornea yara iyileşmesinin çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiştir11,12,13,14,15. Kornea yarasının iyileşmesinin murin modellerinin, normal fizyolojik koşullar altında çalışan kornea yarası iyileşme mekanizmalarını anlamamızı sağlamada yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Kornea yarasının iyileşmesini incelemek için her biri yara iyileşme sürecinin farklı yönlerini araştırmak için uygun olan farklı kornea yaraları türleri kullanılmıştır. Kornea yara iyileşmesi çalışmalarında kullanılan en yaygın yara modeli tipleri mekanik ve kimyasal yara modelleridir. Çoğunlukla korneada alkali yanıkların oluşumunu içeren kimyasal kornea yaraları, kornea ülserlerini, opaklaşmayı ve neovaskülarizasyonu incelemek için yararlıdır13. Mekanik kornea yaraları debridman (aşınma) yaralarını ve keratektomi yaralarını içerir14,15,16. Sağlam veya kırılmış kornea epitel bazal membranı sırasıyla debridman ve keratektomi yaralarını tanımlar. Debridman yaralarında epitel bazal membranı sağlam kalırken, keratektomi yaralarında çoğunlukla anterior stromaya penetrasyon ile bazal membran kırılır. Debridman yaraları, kornea yaralanmasını takiben yeniden epitelizasyon, epitel hücre proliferasyonu, immün yanıt ve sinir rejenerasyonunu incelemek için en yararlı olanlardır. Keratektomi yaraları ise kornea skarlaşmasının incelenmesinde en yararlı olanıdır14,15.

Burada, bir trefin ve künt bir golf kulübü spud kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokol açıklanmaktadır. Bu basit kornea yara iyileşmesi modeli oldukça tekrarlanabilir ve iyi yayınlanmıştır ve şimdi hastalık bağlamında tehlikeye atılmış kornea yara iyileşmesini değerlendirmek için kullanılmaktadır17.

Protocol

Tüm hayvan protokolleri, Houston Üniversitesi ve Baylor Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komiteleri tarafından onaylanmıştır. Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) bildirisinde özetlenen ve hayvanların görme ve oftalmik araştırmalarda kullanımına ilişkin kılavuzlar, farelerin ele alınmasında ve kullanılmasında takip edilmiştir. 1. Hazırlık Floresein çözeltisinin hazırlanması 10 mg sodyum flores…

Representative Results

Şekil 3 , künt golf sopası spud’u ile oluşturulan bir kornea yarasının iletim elektron mikrografını göstererek, epitel bazal membranının yaralanmadan sonra gerçekten sağlam olduğunu göstermektedir. Şekil 3: Epitelyal bazal membran kornea aşınmasından sonra bozulmadan kalır. Künt g…

Discussion

Bu yöntem makalesinin amacı, bir trefin ve künt bir golf sopası tükürüğü kullanarak farede merkezi bir kornea epitelyal aşınma yarası oluşturmak için bir protokolü tanımlamaktı. Bu murin modeli, kornea iltihabını ve yara iyileşmesine katkısını incelemek için kullanılmıştır. Bu tip bir model, normal fizyolojik koşullar altında vepatolojilerde kornea yarası iyileşme mekanizmalarını incelemek için kullanılabilir 17,28,29,41,42.<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finansman: Destekleyen: NIH EY018239 (A.R.B., C.W.S. ve R.E.R.), P30EY007551 (A.R.B.) ve Sigma Xi Grant in Aid of Research (P.K.A.). İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Sigma Xi’nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

Materials

Anti-CD31 antibody BD Bioscience, Pharmingen 550274
Anti-CD41 antibody BD Bioscience, Pharmingen 553847
Anti-Ly6G antibody BD Bioscience, Pharmingen 551459
Bovine serum albumin (BSA) ThermoFisher scientific B14
C57BL/6 mice Jackson Laboratories 664
DAPI Sigma Aldrich D8417
DeltaVision wide-field deconvolution fluorescence microscope GE Life Sciences
Dissecting microscope Leica microsystems
Electronic Toploading Balances (Weighing scale) Fisher Scientific
Ethanol ThermoFisher scientific T038181000CS
Golf-club spud Stephens instruments S2-1135
Iris curve scissors Fisher Scientific 31212
Isoflurane Patterson veterinary 07-893-1389
Ketamine Patterson veterinary 07-890-8598
Phospate buffered saline (PBS) ThermoFisher scientific AM9624
Sodium fluorescein salt Sigma Aldrich 46970
Surgical blade (scapel blade) Fine Science tools 10022-00
Trephine Integra Miltex 33-31
TritonX -100 Fisher Scientific 50-295-34
Forcep Fine Science tools 11923-13
Xylazine Patterson veterinary 07-808-1947
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Meek, K. M., Knupp, C. Corneal structure and transparency. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 1-16 (2015).
  3. Sridhar, M. S. Anatomy of cornea and ocular surface. Indian Journal of Ophthalmology. 66 (2), 190-194 (2018).
  4. Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
  5. Robaei, D., Watson, S. Corneal blindness: A global problem. Clinical & Experimental Ophthalmology. 42 (3), 213-214 (2014).
  6. McGwin, G., Owsley, C. Incidence of emergency department-treated eye injury in the United States. Archives of Ophthalmology. 123 (5), 662-666 (2005).
  7. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  8. Wilson, S. L., Haj, A. J. E., Yang, Y. Control of scar tissue formation in the cornea: Strategies in clinical and corneal tissue engineering. Journal of Functional Biomaterials. 3 (3), 642 (2012).
  9. Vaidyanathan, U., et al. Persistent corneal epithelial defects: A review article. Medical Hypothesis, Discovery and Innovation in Ophthalmology. 8 (3), 163-176 (2019).
  10. Netto, M., et al. Wound healing in the cornea: a review of refractive surgery complications and new prospects for therapy. Cornea. 24 (5), 509-522 (2005).
  11. Friedenwald, J. S., Buschke, W. Some factors concerned in the mitotic and wound-healing activities of the corneal epithelium. Transactions of the American Ophthalmological Society. 42, 371-383 (1944).
  12. Xu, K., Yu, F. -. S. X. Impaired epithelial wound healing and EGFR signaling pathways in the corneas of diabetic rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3301-3308 (2011).
  13. Bai, J. Q., Qin, H. F., Zhao, S. H. Research on mouse model of grade II corneal alkali burn. International Journal of Ophthalmology. 9 (4), 487-490 (2016).
  14. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Stepp, M. A., Zieske, J. D. αVβ6 integrin promotes corneal wound healing. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (11), 8505-8513 (2011).
  15. Blanco-Mezquita, J. T., Hutcheon, A. E. K., Zieske, J. D. Role of thrombospondin-1 in repair of penetrating corneal wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (9), 6262-6268 (2013).
  16. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
  17. Hargrave, A., et al. Corneal dysfunction precedes the onset of hyperglycemia in a mouse model of diet-induced obesity. PLoS ONE. 15, 0238750 (2020).
  18. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (67), e2771 (2012).
  19. Bodner, L., Dayan, D. Effect of parotid submandibular and sublingual saliva on wound healing in rats. Comparative Biochemistry and Physiology. Part A, Physiology. 100 (4), 887-890 (1991).
  20. Abbasian, B., Azizi, S., Esmaeili, A. Effects of rat’s licking behavior on cutaneous wound healing. Iranian Journal of Basic Medical Sciences. 13 (1), 242-247 (2010).
  21. DeLisser, H. M., et al. Involvement of endothelial PECAM-1/CD31 in angiogenesis. The American Journal of Pathology. 151 (3), 671-677 (1997).
  22. Piali, L., et al. CD31/PECAM-1 is a ligand for alpha v beta 3 integrin involved in adhesion of leukocytes to endothelium. The Journal of Cell Biology. 130 (2), 451-460 (1995).
  23. Fleming, T. J., Fleming, M. L., Malek, T. R. Selective expression of Ly-6G on myeloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. The Journal of Immunology. 151 (5), 2399-2408 (1993).
  24. Fleming, T. J., Malek, T. R. Multiple glycosylphosphatidylinositol-anchored Ly-6 molecules and transmembrane Ly-6E mediate inhibition of IL-2 production. The Journal of Immunology. 153 (5), 1955-1962 (1994).
  25. Phillips, D. R., Charo, I. F., Scarborough, R. M. GPIIb-IIIa: the responsive integrin. Cell. 65 (3), 359-362 (1991).
  26. Nieswandt, B., et al. Acute systemic reaction and lung alterations induced by an antiplatelet integrin gpIIb/IIIa antibody in mice. Blood. 94 (2), 684-693 (1999).
  27. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  28. Liu, Q., Smith, C. W., Zhang, W., Burns, A. R., Li, Z. NK cells modulate the inflammatory response to corneal epithelial abrasion and thereby support wound healing. American Journal of Pathology. 181 (2), 452-462 (2012).
  29. Gao, Y., et al. NK cells are necessary for recovery of corneal CD11c+ dendritic cells after epithelial abrasion injury. Journal of Leukocyte Biology. 94 (2), 343-351 (2013).
  30. Xiao, C., et al. Acute tobacco smoke exposure exacerbates the inflammatory response to corneal wounds in mice via the sympathetic nervous system. Communications Biology. 2, 33 (2019).
  31. Wang, H., et al. Epothilone B speeds corneal nerve regrowth and functional recovery through microtubule stabilization and increased nerve beading. Scientific Reports. 8 (1), 2647 (2018).
  32. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Lymphocyte function-associated Antigen-1-dependent inhibition of corneal wound healing. Cell Injury. 169, 1590-1600 (2006).
  33. Wu, M., et al. The neuroregenerative effects of topical decorin on the injured mouse cornea. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 1-14 (2020).
  34. Rodrigues, M., Kosaric, N., Bonham, C. A., Gurtner, G. C. Wound healing: A cellular perspective. Physiological Reviews. 99 (1), 665-706 (2019).
  35. Rennard, S. I. Inflammation and repair processes in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (5), 12-16 (1999).
  36. Landén, N. X., Li, D., Ståhle, M. Transition from inflammation to proliferation: a critical step during wound healing. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (20), 3861-3885 (2016).
  37. Li, Z., Rumbaut, R. E., Burns, A. R., Smith, C. W. Platelet response to corneal abrasion is necessary for acute inflammation and efficient re-epithelialteation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47, 4794-4802 (2006).
  38. Lam, F. W., Burns, A. R., Smith, C. W., Rumbaut, R. E. Platelets enhance neutrophil transendothelial migration via P-selectin glycoprotein ligand-1. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 300 (2), 468-475 (2011).
  39. La Cruz, A. D., et al. Platelet and erythrocyte extravasation across inflamed corneal venules depend on CD18, neutrophils, and mast cell degranulation. International Journal of Molecular Sciences. 22 (14), 7360 (2021).
  40. Li, Z., Burns, A. R., Smith, C. W. Two waves of neutrophil emigration in response to corneal epithelial abrasion: Distinct adhesion molecule requirements. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 47 (5), 1947-1955 (2006).
  41. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF Are Necessary for Efficient Corneal Nerve Regeneration. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  42. Xue, Y., et al. Modulation of circadian rhythms affects corneal epithelium renewal and repair in mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (3), 1865-1874 (2017).
  43. Zhang, W., Magadi, S., Li, Z., Smith, C. W., Burns, A. R. IL-20 promotes epithelial healing of the injured mouse cornea. Experimental Eye Research. 154, 22-29 (2017).
  44. Li, Z., Burns, A. R., Miller, S. B., Smith, C. W. CCL20, γδ T cells, and IL-22 in corneal epithelial healing. FASEB Journal. 25 (8), 2659-2668 (2011).
  45. Li, Z., Burns, A. R., Han, L., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. IL-17 and VEGF are necessary for efficient corneal nerve regeneration. American Journal of Pathology. 178 (3), 1106-1116 (2011).
  46. Reins, R. Y., Hanlon, S. D., Magadi, S., McDermott, A. M. Effects of topically applied Vitamin D during corneal wound healing. PLoS ONE. 11 (4), 0152889 (2016).
  47. Gagen, D., et al. ICAM-1 mediates surface contact between neutrophils and keratocytes following corneal epithelial abrasion in the mouse. Experimental Eye Research. 91 (5), 676-684 (2010).
  48. Li, Z., Rivera, C. A., Burns, A. R., Smith, C. W. Hindlimb unloading depresses corneal epithelial wound healing in mice. Journal of Applied Physiology. 97 (2), 641-647 (2004).
  49. Byeseda, S. E., et al. ICAM-1 is necessary for epithelial recruitment of γδ T cells and efficient corneal wound healing. American Journal of Pathology. 175 (2), 571-579 (2009).
  50. Li, Z., Burns, A. R., Rumbaut, R. E., Smith, C. W. γδ T cells are necessary for platelet and neutrophil accumulation in limbal vessels and efficient epithelial repair after corneal abrasion. American Journal of Pathology. 171 (3), 838-845 (2007).
  51. Petrescu, M. S., et al. Neutrophil interactions with keratocytes during corneal epithelial wound healing: A role for CD18 integrins. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (11), 5023-5029 (2007).
  52. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Experimental Eye Research. 93 (6), 927-936 (2011).
  53. Pal-Ghosh, S., et al. Cytokine deposition alters leukocyte morphology and initial recruitment of monocytes and γδT cells after corneal injury. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2757-2765 (2014).
  54. Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Jurjus, R. A., Zieske, J. D., Stepp, M. A. BALB/c and C57BL6 mouse strains vary in their ability to heal corneal epithelial debridement wounds. Experimental Eye Research. 87 (5), 478-486 (2008).
  55. Kato, T., Chang, J. H., Azar, D. T. Expression of type XVIII collagen during healing of corneal incisions and keratectomy wounds. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 78-85 (2003).
  56. Kure, T., et al. Corneal neovascularization after excimer keratectomy wounds in matrilysin-deficient mice. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44 (1), 137-144 (2003).
  57. Lin, A., et al. Bacterial keratitis preferred practice pattern. Ophthalmology. 126 (1), 1-55 (2019).
  58. Cable, E. J., Onishi, K. G., Prendergast, B. J. Circadian rhythms accelerate wound healing in female Siberian hamsters. Physiology and Behavior. 171, 165-174 (2017).
  59. Lyons, A. B., Moy, L., Moy, R., Tung, R. Circadian rhythm and the skin: A review of the literature. Journal of Clinical and Aesthetic Dermatology. 12 (9), 42-45 (2019).
  60. Westman, J., Grinstein, S., Marques, P. E. Phagocytosis of Necrotic Debris at Sites of Injury and Inflammation. Frontiers in Immunology. 10, 3030 (2020).
  61. Gaudry, M., et al. Intracellular pool of vascular endothelial growth factor in human neutrophils. Blood. 90 (10), 4153-4161 (1997).
  62. Pan, Z., et al. Vascular endothelial growth factor promotes anatomical and functional recovery of injured peripheral nerves in the avascular cornea. FASEB Journal. 7, 2756-2767 (2013).
  63. Di, G., et al. VEGF-B promotes recovery of corneal innervations and trophic functions in diabetic mice. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  64. Thomas, M. R., Storey, R. F. The role of platelets in inflammation. Thrombosis and Haemostasis. 114 (3), 449-458 (2015).
  65. Margraf, A., Zarbock, A. Platelets in inflammation and resolution. The Journal of Immunology. 203 (9), 2357-2367 (2019).

Tags

Epithelial AbrasionCorneal Wound HealingCorneal InflammationCorneal Wounding ModelFluorescein StainingWound ClosureRe-epithelializationImage Analysis
check_url/63112?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Akowuah, P. K., De La Cruz, A., Smith, C. W., Rumbaut, R. E., Burns, A. R. An Epithelial Abrasion Model for Studying Corneal Wound Healing. J. Vis. Exp. (178), e63112, doi:10.3791/63112 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image