Estabelecimento de um modelo de pancreatite aguda grave do rato usando injeção retrógrada de taurocholate de sódio no ducto biliopancreático

Summary

Um modelo de rato de pancreatite aguda grave é descrito aqui. O procedimento aqui apresentado é muito rápido, simples e acessível, permitindo, assim, potencialmente o estudo dos mecanismos moleculares e diferentes intervenções terapêuticas na pancreatite aguda de forma conveniente.

Abstract

A prevalência de pancreatite aguda (AP), especialmente pancreatite aguda grave (SAP), está aumentando anualmente em faixas etárias mais jovens. No entanto, faltam tratamentos eficazes na prática clínica atual. Com a fácil acessibilidade das cepas transgênicas e eliminatórias e seu pequeno tamanho, que permite doses mínimas de medicamentos necessários para avaliação in vivo , um modelo experimental bem estabelecido em camundongos é preferido para a pesquisa ap. Além disso, a SAP induzida através de taurocholate de sódio (TC) é atualmente um dos modelos mais utilizados e caracterizados. Este modelo tem sido investigado para novas terapias e possíveis eventos moleculares durante o processo de AP. Aqui, apresentamos a geração de um modelo de mouse AP usando taurocholate de sódio e uma simples microsinga caseira. Além disso, também fornecemos a metodologia para a histologia subsequente e testes sorológicos.

Introduction

Pancreatite aguda (AP) é uma inflamação aguda do pâncreas caracterizada pela obstrução do duto pancreático principal com distensão ductal subsequente e autogestão do pâncreas por suas enzimas anormalmente ativadas. Suas manifestações clínicas incluem inflamação local ou sistêmica, dor abdominal e elevação do amilase ^sérico1,2. De acordo com a classificação de ^gravidade3, a AP pode apresentar-se em formas leves, moderadas e graves, e entre elas, a pancreatite aguda grave (SAP) é a condição mais preocupante devido à sua alta taxa de mortalidade superior a 30%⁴. Nos Estados Unidos, a AP é uma das razões mais comuns para a internação, afetando mais de 200.000 ^pacientes5. Além disso, a AP, especialmente a SAP, está aumentando anualmente e afetando as faixas etárias mais ^jovens6. No entanto, faltam opções de tratamento eficazes na prática clínica ^atual6,7. Portanto, é necessário explorar os mecanismos moleculares envolvidos na AP, facilitando assim a melhoria do tratamento.

Modelos experimentais de animais bem estabelecidos são necessários para estudar os mecanismos envolvidos na AP e avaliar a eficácia de diferentes modalidades de tratamento. Com a fácil acessibilidade das cepas transgênicas e eliminatórias e seu pequeno tamanho, o que minimiza as doses de medicamentos necessários para avaliação in vivo, os camundongos são preferidos para a pesquisa ap. Portanto, vários modelos de AP foram desenvolvidos em ^{camundongos8,9}.

Trabalhando a partir de um modelo leve de rato de pancreatite induzido através da administração intravenosa de ^caerulein10, Niederau et al. desenvolveram um modelo de rato SAP apresentado com necrose celular acinar induzida usando a mesma droga e rota ^{de injeção11}. Embora este modelo possua várias vantagens, incluindo invasividade, indução rápida, reprodutibilidade ampla e aplicabilidade, a maior desvantagem é que apenas uma forma leve de AP é desenvolvida na maioria dos casos, limitando assim sua relevância clínica. O álcool é considerado um dos principais fatores etiológicos da AP; no entanto, Foitzik et al. relataram que causa lesão pancreática apenas quando combinado com outros fatores, como hiperestimulação ^exócrina12. Além disso, embora os modelos ap induzidos pelo álcool tenham sido desenvolvidos através de diferentes rotas de administração, e as doses de drogas tenham sido relatadas13,14,15, sua maior desvantagem é a dificuldade em reproduzi-los. A administração intraperitoneal de L-arginina também pode induzir AP em ^{camundongos16}; no entanto, sua baixa relevância clínica dificulta sua aplicação. Taurocholate, um sal bile, foi proposto pela primeira vez por Creutzfeld et al. em 1965 por induzir uma condição semelhante à AP humana através da infusão de ducto pancreático17. Embora existam controvérsias quanto à sua relevância clínica na fisiopatologia18,19, a pancreatite induzida por taurocolato continua sendo um modelo indispensável para a SAP.

Como este modelo é simples de perceber e também é eficaz em camundongos, é hoje um dos modelos AP mais utilizados para pequenos estudos in vivo. Perides et al. empregaram taurocholate de sódio (TC) para induzir SAP em ^{camundongos20}, fornecendo insights para entender sua patologia. Combinado com técnicas de modificação genética, este modelo nos permitiu confirmar vários genes específicos envolvidos na AP. Por exemplo, Bicozo et al. mostraram que um nocaute do gene CD38 protegeu contra um modelo de pancreatite de infusão TC e atribuiu os mecanismos a alterações na sinalização intracelular ^Ca2+21. Fanczal et al. investigaram a implicação fisiológica da expressão TRPM2 na membrana plasmática do acinar pancreático do rato e células ductais, e demonstraram gravidade reduzida da SAP induzida por TC em camundongos nocautes TRPM222. Além disso, este modelo também fornece uma maneira simples e eficaz de testar muitas drogas novas in vivo. Por exemplo, este método permitiu a validação dos efeitos terapêuticos da ^cafeína23, ácido desiddrocólico24, e vários antioxidantes e anticoagulantes25,26. Esta evidência demonstra a versatilidade do modelo SAP induzido por TC. Embora Wittel et al. tenham descrito um modelo semelhante de ^mouse27, a falta de detalhes sobre os procedimentos de implementação poderia resultar em uma incapacidade de reproduzir os achados. Neste artigo, focamos em métodos utilizando uma simples microsinga caseira e estudamos SAP induzida por TC, fornecendo assim uma possível orientação não apenas para um estudo mais aprofundado da patogênese e tratamento da AP, mas também para um método experimental perfeitamente adaptável para muitas outras substâncias.

Protocol

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Soochow. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob anestesia total. Os analgésicos não foram utilizados para evitar interferências no curso natural da doença segundo as literaturas anteriores28,29. A aprovação da falta de analgesia também foi concedida pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Soochow. <st…

Representative Results

Seguindo cuidadosamente as instruções acima, obtivemos uma duração média da cirurgia de aproximadamente 40 min. Os camundongos estavam ligeiramente inativos e perderam aproximadamente 0,5-1,75 g, 0,85-1,85 g e 0,5-4,73 g de peso em 24 h, 48 h e 72 h pós-operação, respectivamente (Figura 2). Desde o momento da conclusão da cirurgia até 24 horas após a operação, à medida que a doença se desenvolveu, os camundongos ficaram inativos e apresentaram respo…

Discussion

O modelo SAP induzido pelo TC é uma excelente ferramenta de pesquisa. Como mostrado neste estudo, este modelo é muito facilmente realizado em laboratórios gerais sem empregar dispositivos específicos. Quando usado em combinação com histologia e análise bioquímica, fornece uma abordagem de custo (reagentes baratos) e economia de tempo (24h de janela de tempo) para induzir e avaliar AP. Ajustar a concentração de TC também oferece a possibilidade de produzir ap. Perides et al. também empregaram TC para induzir S…

Materials

0.5% iodophor	Shanghai Likang Disinfectant	310102	4 mL/mouse
0.9% sodium chloride	Sinopharm Group Co., Ltd.	10019318	0.8 mL/mouse
1% Pentobarbital sodium	Sigma	P3761	0.2 -0.25 mL/mouse
25 μL flat tip Microliter syringe	Gaoge, Shanghai	A124019
4% Paraformaldehyde	Beyotime, Nantong, China	P0099-500ml
5% sodium taurocholate (TC)	Aladdin	S100834-5g	10 μL/SAP mouse
6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle)	Cheng-He	20093
75% alcohol	Sinopharm Group Co., Ltd.	10009218	4 mL/mouse
8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle)	Cheng-He	19064
ALT Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	ALT0012
Amylase Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AMY0012
Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm)	Cheng-He	HC-X022
aspen shavings or shreds for mouse bedding	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	VR03015
AST Activity Assay Kit	EPNK, Anhui, China	AST0012
Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit	EPNK, Anhui, China	BUN0011
C57BL/6 mouse	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	213
Creatine Assay Kit	EPNK, Anhui, China	CRE0012
Feature microtome blade	Beyotime, Nantong, China	E0994
Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	JC3901
Lipase Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A054-2-1
Microtome	Leica biosystem, Germany	RM2245
Mindray biochemistry analyzer	Mindray, Shenzhen, China	BS-420
MPO Assay Kit	Jiancheng, Nanjing, China	A044-1-1
Normal mouse chow	Trophic, Nantong, China	LAD 1000
Phosphate buffered saline	Beyotime, Nantong, China	C0221A
Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm)	JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd.	W40130
Straight or curved forceps (11.0 cm)	Cheng-He	HC-X091A or HC-X090A
Straight Scissors (10.0 cm)	Cheng-He, Ningbo, China	HC-J039102
Thermo Scientific Centrifuge	Thermo Scientific, USA	Multifuge X1R