Etablering af en mus alvorlig akut pancreatitismodel ved hjælp af retrograd injektion af natrium taurocholat i den biliopancreatiske kanal
Summary
En musemodel af svær akut pancreatitis er beskrevet heri. Proceduren, der præsenteres her, er meget hurtig, enkel og tilgængelig, hvilket potentielt muliggør undersøgelse af de molekylære mekanismer og forskellige terapeutiske indgreb i akut pancreatitis på en bekvem måde.
Abstract
Forekomsten af akut pancreatitis (AP), især alvorlig akut pancreatitis (SAP), stiger årligt i yngre aldersgrupper. Der mangler dog effektive behandlinger i den nuværende kliniske praksis. Med den lette tilgængelighed af transgene og knockout-stammer og deres lille størrelse, som tillader minimale doser af lægemidler, der kræves til in vivo-evaluering , foretrækkes en veletableret eksperimentel model i mus til AP-forskning. Desuden er SAP induceret gennem natrium taurocholat (TC) i øjeblikket en af de mest anvendte og bedst karakteriserede modeller. Denne model er blevet undersøgt for nye terapier og mulige molekylære hændelser under AP-processen. Her præsenterer vi genereringen af en AP-musemodel ved hjælp af natriumtærocholat og en simpel hjemmelavet mikrosyringe. Desuden leverer vi også metoden til den efterfølgende histologi og serologiske test.
Introduction
Akut pancreatitis (AP) er en akut betændelse i bugspytkirtlen karakteriseret ved obstruktion af den vigtigste bugspytkirtelkanal med efterfølgende duktal distension og fordøjelse i bugspytkirtlen ved hjælp af dets unormalt aktiverede enzymer. Dens kliniske manifestationer omfatter lokal eller systemisk betændelse, mavesmerter og forhøjelse af serumamylase1,2. Ifølge sværhedsgradsklassifikationen3 kan AP præsentere i milde, moderate og svære former, og blandt dem er alvorlig akut pancreatitis (SAP) den mest bekymrende tilstand på grund af dens høje dødelighed på mere end 30%4. I USA er AP en af de mest almindelige årsager til indlæggelse, der påvirker over 200.000 patienter5. Desuden stiger AP, især SAP, årligt og påvirker yngre aldersgrupper6. Der mangler imidlertid effektive behandlingsmuligheder i den nuværende kliniske praksis6,7. Derfor er det nødvendigt at undersøge de molekylære mekanismer, der er involveret i AP, og derved lette behandlingsforbedringen.
Der kræves veletablerede forsøgsdyremodeller for at studere de mekanismer, der er involveret i AP og evaluere effektiviteten af forskellige behandlingsmetoder. Med den lette tilgængelighed af transgene og knockout-stammer og deres lille størrelse, hvilket minimerer de doser af lægemidler, der kræves til in vivo-evaluering, foretrækkes mus til AP-forskning. Derfor er der udviklet flere modeller af AP i mus8,9.
Niederau et al. arbejdede ud fra en mild pancreatitis rottemodel induceret gennem intravenøs administration af caerulein10 og udviklede en SAP-musemodel præsenteret med acinarcellenekrose induceret ved anvendelse af det samme lægemiddel og injektionsvej11. Selvom denne model har flere fordele, herunder noninvasivitet, hurtig induktion, bred reproducerbarhed og anvendelighed, er den største ulempe, at kun en mild form for AP udvikles i de fleste tilfælde og derved begrænser dens kliniske relevans. Alkohol betragtes som en af de vigtigste etiologiske faktorer i AP; Foitzik et al. rapporterede imidlertid, at det kun forårsager bugspytkirtelskade, når det kombineres med andre faktorer, såsom eksokrin hyperstimulering12. Desuden, selvom alkoholinducerede AP-modeller udviklet via forskellige administrationsveje, og lægemiddeldoser er blevet rapporteret13,14,15, er deres største ulempe vanskeligheden ved at reproducere dem. Intraperitoneal administration af L-arginin kan også inducere AP i mus16; dens lave kliniske relevans hindrer imidlertid dens anvendelse. Taurocholat, et galdesalt, blev først foreslået af Creutzfeld et al. i 1965 for at fremkalde en tilstand, der ligner human AP via infusion af bugspytkirtelkanalen17. Selvom der er kontroverser om dets kliniske relevans inden for patofysiologi18,19, er taurocholatinduceret pancreatitis fortsat en uundværlig model for SAP.
Da denne model er enkel at realisere og også er effektiv i mus, er den nu en af de mest anvendte AP-modeller til in vivo-undersøgelser af små dyr. Perides et al. anvendte natrium taurocholat (TC) til at inducere SAP i mus20, hvilket giver indsigt i at forstå dets patologi. Kombineret med genetiske modifikationsteknikker har denne model gjort det muligt for os at bekræfte flere specifikke gener, der er involveret i AP. For eksempel viste Bicozo et al., at en knockout af CD38-genet beskyttede mod en model af TC-infusion pancreatitis og tilskrev mekanismerne ændringer i intracellulær Ca2+ signalering21. Fanczal et al. undersøgte den fysiologiske implikation af TRPM2-ekspression i plasmamembranen i musens bugspytkirtel-acinar- og duktale celler og viste reduceret sværhedsgrad af TC-induceret SAP i TRPM2 knockout-mus22. Desuden giver denne model også en enkel og effektiv måde at teste mange nye lægemidler in vivo på. For eksempel muliggjorde denne metode validering af de terapeutiske virkninger af koffein23, dehydrocholsyre24 og forskellige antioxidanter og antikoagulantia25,26. Dette bevis viser alsidigheden af den TC-inducerede SAP-model. Selvom Wittel et al. beskrev en lignende musemodel27, kunne en mangel på detaljer om implementeringsprocedurerne resultere i manglende evne til at reproducere resultaterne. I denne artikel fokuserer vi på metoder, der bruger en simpel hjemmelavet mikrosyringe og studerer TC-induceret SAP og derved giver mulig vejledning ikke kun til videre undersøgelse af patogenesen og behandlingen af AP, men også til en perfekt tilpasningsdygtig eksperimentel metode til mange andre stoffer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den TC-inducerede SAP-model er et fremragende forskningsværktøj. Som vist i denne undersøgelse er denne model meget let realiseret i generelle laboratorier uden at anvende specifikke enheder. Når det anvendes i kombination med histologi og biokemisk analyse, giver det en omkostnings- (billige reagenser) og tidsbesparende (24 timers tidsvindue) tilgang til at inducere og evaluere AP. Justering af koncentrationen af TC giver også mulighed for at producere mild og moderat AP. Perides et al. anvendte også TC til at ind…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for støtten fra følgende tilskud: et translationelt forskningsstipendium fra NCRCH [2020WSA01], et KJXW Videnskabeligt tilskud fra Suzhou Commission of Health for Young Scholars [KJXW2020002], en videnskabs- og teknologiplan for Suzhou City (SKY2021038 og SKJY2021050), et tilskud fra Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) og en primær forsknings- og social udviklingsplan for Jiangsu-provinsen (BE2018659).
Materials
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
References
- Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
- Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959 (2018).
- Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
- Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
- Hines, O. J., Pandol, S. J. Management of severe acute pancreatitis. BMJ. 367, 6227 (2019).
- James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
- Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794 (2019).
- Hyun, J. J., Lee, H. S. Experimental models of pancreatitis. Clinical Endoscopy. 47 (3), 212-216 (2014).
- Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
- Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
- Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
- Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
- Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588 (2015).
- Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
- Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
- Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
- Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
- Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
- Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
- Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
- Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
- Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
- Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
- Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).
