Etablering av en mus svår akut pankreatit modell med retrograd injektion av natrium taurocholate i biliopancreatic duct
Summary
En mus modell av allvarliga akut bukspottkörtelinflammation beskrivs häri. Förfarandet som presenteras här är mycket snabb, enkel och tillgänglig, vilket potentiellt tillåter studier av molekylära mekanismer och olika terapeutiska interventioner i akut bukspottkörtelinflammation på ett bekvämt sätt.
Abstract
Prevalensen av akut pankreatit (AP), särskilt svår akut bukspottkörtelinflammation (SAP), ökar i yngre åldersgrupper årligen. Det saknas dock effektiva behandlingar i den nuvarande kliniska praktiken. Med den enkla tillgängligheten av transgena och knockout stammar och deras lilla storlek, vilket möjliggör minimala doser av läkemedel som krävs för in vivo utvärdering, en väletablerad experimentell modell hos möss föredras för AP-forskning. Dessutom är SAP inducerad genom natriumtaurocholate (TC) för närvarande en av de mest använda och bäst karakteriserade modellerna. Denna modell har undersökts för nya terapier och möjliga molekylära händelser under processen med AP. Här presenterar vi genereringen av en AP-musmodell med natriumtaurokolit och en enkel hemlagad microsyringe. Dessutom tillhandahåller vi också metoden för efterföljande histologi och serologisk testning.
Introduction
Akut bukspottkörtelinflammation (AP) är en akut inflammation i bukspottkörteln som kännetecknas av obstruktion av huvud bukspottskörteln trumman med efterföljande duktal distension och bukspottkörtel autodigestion av dess onormalt aktiverade enzymer. Dess kliniska manifestationer inkluderar lokala eller systemiska inflammation, buken smärta och höjd serum amylas1,2. Enligt allvarlighetsgradsklassificeringen3 kan AP förekomma i milda, måttliga och svåra former, och bland dem är svår akut pankreatit (SAP) det mest oroande tillståndet på grund av dess höga dödlighet på mer än 30%4. I USA är AP en av de vanligaste orsakerna till sjukhusvistelse, som påverkar över 200 000 patienter5. Dessutom ökar AP, särskilt SAP, årligen och påverkar yngre åldersgrupper6. Det saknas dock effektiva behandlingsalternativ i nuvarande klinisk praxis6,7. Därför är det nödvändigt att utforska de molekylära mekanismer som är involverade i AP, vilket underlättar behandlingsförbättring.
Väletablerade experimentella djurmodeller krävs för att studera mekanismerna i AP och utvärdera effektiviteten hos olika behandlingsmetoder. Med den enkla tillgängligheten av transgena och knockout stammar och deras lilla storlek, som minimerar doserna av läkemedel som krävs för in vivo utvärdering, möss föredras för AP forskning. Därför har flera modeller av AP utvecklats hos möss8,9.
Arbetar från en mild pankreatit råtta modell induceras genom intravenös administrering av caerulein10, Niederau et al. utvecklat en SAP mus modell presenteras med acinar cell nekros induceras med samma läkemedel och injektionsväg11. Även om denna modell har flera fördelar, inklusive noninvasiveness, snabb induktion, bred reproducerbarhet och tillämplighet, är den största nackdelen att endast en mild form av AP utvecklas i de flesta fall, vilket begränsar dess kliniska relevans. Alkohol anses vara en av de viktigaste etiologiska faktorerna i AP; rapporterade dock att det orsakar bukspottskörteln skada endast i kombination med andra faktorer, såsom exocrine hyperstimulering12. Dessutom, även om alkoholinducerade AP-modeller utvecklats via olika administreringsvägar, och läkemedelsdoser har rapporterats13,14,15, är deras största nackdel svårigheten att reproducera dem. Intraperitoneal administrering av L-arginin kan också inducera AP hos möss16; dess låga kliniska relevans hindrar dock dess tillämpning. Taurocholate, ett gallsalt, föreslogs först av Creutzfeld et al. 1965 för att inducera ett tillstånd som liknar mänsklig AP via bukspottskörteln trumman infusion17. Även om kontroverser finns om dess kliniska relevans i patofysiologi18,19, är taurocholate-inducerad pankreatit fortfarande en oumbärlig modell för SAP.
Eftersom denna modell är enkel att realisera och också är effektiv hos möss, är det nu en av de mest använda AP-modellerna för smådjur in vivo-studier. använde natriumtaurokolat (TC) för att inducera SAP hos möss20, vilket ger insikter för att förstå dess patologi. I kombination med genetiska modifieringstekniker har denna modell gjort det möjligt för oss att bekräfta flera specifika gener involverade i AP. Visade till exempel att en knockout av CD38 genen skyddas mot en modell av TC-infusion pankreatit och tillskrev mekanismerna till förändringar i intracellulära Ca2 + signalering21. undersökte den fysiologiska implikationen av TRPM2 uttryck i plasma membranet i mus bukspottskörteln acinar och duktal celler, och visat minskad svårighetsgrad av TC-inducerad SAP i TRPM2 knockout möss22. Dessutom ger denna modell också ett enkelt och effektivt sätt att testa många nya läkemedel in vivo. Till exempel möjliggjorde denna metod validering av de terapeutiska effekterna av koffein23, dehydrokolsyra24 och olika antioxidanter och antikoagulantia25,26. Detta bevis visar mångsidigheten hos den TC-inducerade SAP-modellen. Även om Wittel m.fl. beskrev en liknande musmodell27, kan en brist på detaljer om genomförandeförfarandena resultera i en oförmåga att reproducera resultaten. I den här artikeln fokuserar vi på metoder med hjälp av en enkel hemlagad mikrosyring och studeraR TC-inducerad SAP, vilket ger möjlig vägledning inte bara för vidare studier av patogenesen och behandling av AP, men också för en perfekt anpassningsbar experimentell metod för många andra ämnen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den TC-inducerade SAP-modellen är ett utmärkt forskningsverktyg. Som visas i denna studie är denna modell mycket lätt realiserad i allmänna laboratorier utan att använda specifika enheter. När det används i kombination med histologi och biokemisk analys ger det en kostnad – (billiga reagenser) och tidsbesparande (24 h tidsfönster) metod för att inducera och utvärdera AP. Att justera koncentrationen av TC erbjuder också möjligheten att producera mild och måttlig AP. Perides et al. också använde TC för att…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för stödet från följande bidrag: ett translationellt forskningsanslag från NCRCH [2020WSA01], ett KJXW Scientific Grant från Suzhou Commission of Health for Young Scholars [KJXW202020002], en vetenskaplig och teknisk plan för Suzhou City (SKY2021038 och SKJY2021050), ett bidrag från den prioriterade akademiska programutvecklingen för Jiangsu Higher Education Institutions (SKY2021038 och SKJY2021050), ett bidrag från den prioriterade akademiska programutvecklingen av Jiangsu Higher Education Institutions (SKY2021038 och SKJY2021050), ett bidrag från den prioriterade akademiska programutvecklingen för Jiangsu Higher Education Institutions (SKY2021038 och SKJY2021050), ett bidrag från den prioriterade akademiska programutvecklingen för Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| 0.5% iodophor | Shanghai Likang Disinfectant | 310102 | 4 mL/mouse |
| 0.9% sodium chloride | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10019318 | 0.8 mL/mouse |
| 1% Pentobarbital sodium | Sigma | P3761 | 0.2 -0.25 mL/mouse |
| 25 μL flat tip Microliter syringe | Gaoge, Shanghai | A124019 | |
| 4% Paraformaldehyde | Beyotime, Nantong, China | P0099-500ml | |
| 5% sodium taurocholate (TC) | Aladdin | S100834-5g | 10 μL/SAP mouse |
| 6-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (1/2 circle) | Cheng-He | 20093 | |
| 75% alcohol | Sinopharm Group Co., Ltd. | 10009218 | 4 mL/mouse |
| 8-0 Sterile nylon microsuture with threaded needle (3/8 circle) | Cheng-He | 19064 | |
| ALT Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | ALT0012 | |
| Amylase Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AMY0012 | |
| Angled small bulldog clamp with 12 mm jaw (3 cm) | Cheng-He | HC-X022 | |
| aspen shavings or shreds for mouse bedding | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | VR03015 | |
| AST Activity Assay Kit | EPNK, Anhui, China | AST0012 | |
| Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay Kit | EPNK, Anhui, China | BUN0011 | |
| C57BL/6 mouse | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology | 213 | |
| Creatine Assay Kit | EPNK, Anhui, China | CRE0012 | |
| Feature microtome blade | Beyotime, Nantong, China | E0994 | |
| Hemostatic Forceps (9.5 cm, Curved) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | JC3901 | |
| Lipase Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A054-2-1 | |
| Microtome | Leica biosystem, Germany | RM2245 | |
| Mindray biochemistry analyzer | Mindray, Shenzhen, China | BS-420 | |
| MPO Assay Kit | Jiancheng, Nanjing, China | A044-1-1 | |
| Normal mouse chow | Trophic, Nantong, China | LAD 1000 | |
| Phosphate buffered saline | Beyotime, Nantong, China | C0221A | |
| Straight micro-bulldog clamp with 5 mm jaw (1.5 cm) | JZ, Shanghai Medical Instruments Co. Ltd. | W40130 | |
| Straight or curved forceps (11.0 cm) | Cheng-He | HC-X091A or HC-X090A | |
| Straight Scissors (10.0 cm) | Cheng-He, Ningbo, China | HC-J039102 | |
| Thermo Scientific Centrifuge | Thermo Scientific, USA | Multifuge X1R |
References
- Lee, P. J., Papachristou, G. I. New insights into acute pancreatitis. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. 16 (8), 479-496 (2019).
- Mandalia, A., Wamsteker, E. J., DiMagno, M. J. Recent advances in understanding and managing acute pancreatitis. F1000Research. 7, 959 (2018).
- Banks, P. A., et al. Classification of acute pancreatitis-2012: revision of the Atlanta classification and definitions by international consensus. Gut. 62 (1), 102-111 (2013).
- Munir, F., et al. Advances in immunomodulatory therapy for severe acute pancreatitis. Immunology Letters. 217, 72-76 (2020).
- Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143 (5), 1179-1187 (2012).
- Hines, O. J., Pandol, S. J. Management of severe acute pancreatitis. BMJ. 367, 6227 (2019).
- James, T. W., Crockett, S. D. Management of acute pancreatitis in the first 72 hours. Current Opinion in Gastroenterology. 34 (5), 330-335 (2018).
- Silva-Vaz, P., et al. Murine models of acute pancreatitis: a critical appraisal of clinical relevance. International Journal of Molecular Sciences. 20 (11), 2794 (2019).
- Hyun, J. J., Lee, H. S. Experimental models of pancreatitis. Clinical Endoscopy. 47 (3), 212-216 (2014).
- Renner, I. G., Wisner, J. R., Rinderknecht, H. Protective effects of exogenous secretin on ceruletide-induced acute pancreatitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 72 (3), 1081-1092 (1983).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5), 1192-1204 (1985).
- Foitzik, T., et al. Exocrine hyperstimulation but not pancreatic duct obstruction increases the susceptibility to alcohol-related pancreatic injury. Archives in Surgery. 129 (10), 1081-1085 (1994).
- Schneider, L., Dieckmann, R., Hackert, T., Gebhard, M. M., Werner, J. Acute alcohol-induced pancreatic injury is similar with intravenous and intragastric routes of alcohol administration. Pancreas. 43 (1), 69-74 (2014).
- Huang, W., et al. Fatty acid ethyl ester synthase inhibition ameliorates ethanol-induced Ca2+-dependent mitochondrial dysfunction and acute pancreatitis. Gut. 63 (8), 1313-1324 (2014).
- Sun, J., et al. NRF2 mitigates acute alcohol-induced hepatic and pancreatic injury in mice. Food and Chemical Toxicology. 121, 495-503 (2018).
- Kui, B., et al. New insights into the methodology of L-arginine-induced acute pancreatitis. PLoS One. 10 (2), 0117588 (2015).
- Creutzfeldt, W., Schmidt, H., Horbach, I. Studies on the effects of a trypsin inhibitor (Trasylol) on Enzyme activities and morphology in taurocholate and calciphylaxis pancreatitis of the rat (a contribution to the pathogenesis of pancreatitis). Klin Wochenschr. 43, 15-22 (1965).
- Liu, Z. H., et al. A simple taurocholate-induced model of severe acute pancreatitis in rats. World Journal of Gastroenterology. 15 (45), 5732-5739 (2009).
- Cavdar, F., et al. Controversial issues in biliary pancreatitis: when should we perform MRCP and ERCP. Pancreatology. 14 (5), 411-414 (2014).
- Perides, G., van Acker, G. J., Laukkarinen, J. M., Steer, M. L. Experimental acute biliary pancreatitis induced by retrograde infusion of bile acids into the mouse pancreatic duct. Nature Protocols. 5 (2), 335-341 (2010).
- Orabi, A. I., et al. Cluster of differentiation 38 (CD38) mediates bile acid-induced acinar cell injury and pancreatitis through cyclic ADP-ribose and intracellular calcium release. Journal of Biological Chemistry. 288 (38), 27128-27137 (2013).
- Fanczal, J., et al. TRPM2-mediated extracellular Ca(2+) entry promotes acinar cell necrosis in biliary acute pancreatitis. Journal of Physiology. 598 (6), 1253-1270 (2020).
- Huang, W., et al. Caffeine protects against experimental acute pancreatitis by inhibition of inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-mediated Ca2+ release. Gut. 66 (2), 301-313 (2017).
- Zhang, X., et al. Dehydrocholic acid ameliorates sodium taurocholate-induced acute biliary pancreatitis in mice. Biology and Pharmaceutical Bulletin. 43 (6), 985-993 (2020).
- Hagiwara, S., et al. Antithrombin III prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Pancreas. 38 (7), 746-751 (2009).
- Hagiwara, S., et al. Danaparoid sodium prevents cerulein-induced acute pancreatitis in rats. Shock. 32 (1), 94-99 (2009).
- Wittel, U. A., et al. Taurocholate-induced pancreatitis: a model of severe necrotizing pancreatitis in mice. Pancreas. 36 (2), 9-21 (2008).
- Barlass, U., et al. Morphine worsens the severity and prevents pancreatic regeneration in mouse models of acute pancreatitis. Gut. 67 (4), 600-602 (2018).
- Wu, D., et al. A systematic review of NSAIDs treatment for acute pancreatitis in animal studies and clinical trials. Clinical Research in Hepatology and Gastroenterology. 44, 100002 (2020).
- Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Annals in Surgery. 215 (1), 44-56 (1992).
- Junyuan, Z., et al. Quercetin protects against intestinal barrier disruption and inflammation in acute necrotizing pancreatitis through TLR4/MyD88/p38MAPK and ERS inhibition. Pancreatology. 18 (7), 742-752 (2018).
- Waldron, R. T., et al. The Orai Ca(2+) channel inhibitor CM4620 targets both parenchymal and immune cells to reduce inflammation in experimental acute pancreatitis. Journal of Physiology. 597 (12), 3085-3105 (2019).
- Petersen, O. H., Gerasimenko, J. V., Gerasimenko, O. V., Gryshchenko, O., Peng, S. The roles of calcium and ATP in the physiology and pathology of the exocrine pancreas. Physiological Reviews. 101 (4), 1691-1744 (2021).
