DetectSyn: Une méthode fluorescente rapide et impartiale pour détecter les changements dans la densité des synapses

Summary

DetectSyn est un test fluorescent rapide et impartial qui mesure les changements dans le nombre relatif de synapses (engagement pré- et postsynaptique) entre les traitements ou les états pathologiques. Cette technique utilise une technique de ligature de proximité qui peut être utilisée à la fois dans les neurones cultivés et les tissus fixes.

Abstract

Les synapses sont le site de communication entre les neurones. La force du circuit neuronal est liée à la densité synaptique, et la dégradation des synapses est caractéristique des états pathologiques comme le trouble dépressif majeur (TDM) et la maladie d’Alzheimer. Les techniques traditionnelles pour étudier le nombre de synapses comprennent l’expression génétique de marqueurs fluorescents (p. ex., protéine fluorescente verte (GFP)), les colorants qui remplissent un neurone (p. ex., colorant à la carbocyanine, DiI) et la détection immunofluorescente des marqueurs de la colonne vertébrale (p. ex., densité postsynaptique 95 (DSP95)). Une mise en garde majeure à ces techniques de proxy est qu’elles n’identifient que les changements postsynaptiques. Pourtant, une synapse est une connexion entre une borne présynaptique et une colonne vertébrale postsynaptique. L’étalon-or pour mesurer la formation / élimination des synapses nécessite des techniques de microscopie électronique ou de tomographie par réseau qui prennent beaucoup de temps. Ces techniques nécessitent une formation spécialisée et un équipement coûteux. De plus, seul un nombre limité de neurones peut être évalué et est utilisé pour représenter les changements dans toute une région du cerveau. DetectSyn est une technique fluorescente rapide qui identifie les changements dans la formation ou l’élimination des synapses en raison d’un état pathologique ou d’une activité médicamenteuse. DetectSyn utilise un test de ligature de proximité rapide pour détecter les protéines pré- et postsynaptiques juxtaposées et la microscopie fluorescente standard, une technique facilement disponible pour la plupart des laboratoires. La détection fluorescente de la ponctuation résultante permet une analyse rapide et impartiale des expériences. DetectSyn fournit des résultats plus représentatifs que la microscopie électronique car de plus grandes zones peuvent être analysées qu’un nombre limité de neurones fluorescents. De plus, DetectSyn fonctionne pour les neurones cultivés in vitro et les tranches de tissus fixes. Enfin, une méthode est fournie pour analyser les données collectées à partir de cette technique. Dans l’ensemble, DetectSyn offre une procédure pour détecter les changements relatifs dans la densité des synapses à travers les traitements ou les états pathologiques et est plus accessible que les techniques traditionnelles.

Introduction

Les synapses sont l’unité fondamentale de communication entre les neurones¹. De nombreuses synapses entre neurones au sein d’une même région donnent naissance à des circuits qui médient le comportement². Les synapses sont constituées d’un terminal présynaptique d’un neurone qui libère des neurotransmetteurs ou des neuropeptides qui relaient l’information aux récepteurs postsynaptiques d’un autre neurone. La somme des signaux présynaptiques détermine si le neurone postsynaptique déclenchera un potentiel d’action et propagera le message à d’autres neurones.

La synaptopathologie, la décomposition des synapses, survient dans les maladies et les troubles marqués par une diminution du volume neuronal, comme la maladie d’Alzheimer et le trouble dépressif majeur, entraînant des circuits qui ne fonctionnent plus de manière optimale ^3,4,5. La restauration de la densité synaptique sous-tend probablement l’efficacité des traitements potentiels pour ces troubles. Par exemple, il a été récemment démontré que l’augmentation des synapses sous-tend l’efficacité comportementale des antidépresseurs rapides⁶. Pour dépister rapidement les traitements synaptopathologiques possibles, les chercheurs ont besoin de techniques qui identifient rapidement les changements dans le nombre de synapses.

Les méthodologies actuelles sont soit longues et coûteuses (microscopie électronique, tomographie en réseau), soit elles n’examinent que les changements postsynaptiques sans intégrer l’engagement présynaptique (analyses de la colonne vertébrale, immunofluorescence/colocalisation). Les colorants comme DiI ou les protéines fluorescentes comme GFP aident à visualiser les neurones et à caractériser les épines postsynaptiques. Cependant, l’analyse de la colonne vertébrale utilise des ratios définis par les chercheurs pour déterminer la morphologie, ce qui peut diminuer la reproductibilité⁷. De plus, la façon dont les différentes classes de colonne vertébrale se rapportent aux synapses fonctionnelles est encore en cours de^{découverte 8}. La formation de la colonne vertébrale peut être transitoire et peut refléter une plasticité postsynaptique, mais ces épines pourraient être éliminées avant de se stabiliser en une synapse avec un neurone présynaptique⁹.

La colocalisation fournit un meilleur indicateur pour les synapses que l’analyse de la colonne vertébrale, car on peut s’immunocolorer pour les protéines présynaptiques et postsynaptiques. Cependant, les protéines synaptiques peuvent donner de faibles valeurs de colocalisation parce que les protéines sont juxtaposées et peuvent ne pas se chevaucher de manière cohérente. Ainsi, comme les protéines ne sont pas entièrement superposées, les techniques de colocalisation peuvent ne pas mesurer avec précision les changements dans la formation des synapses en raison de ces informations manquantes. Enfin, bien que la microscopie électronique (EM) et la tomographie en réseau fournissent des images à haute résolution des synapses, elles prennent beaucoup de temps. L’EM nécessite en outre un équipement spécialisé, et les chercheurs sont limités à de petits volumes de tissus pour une expérience donnée. Alors que la tomographie en réseau offre élégamment la possibilité de dépister de nombreuses protéines sur des sections ultraminces et peut être combinée avec EM¹⁰, cette technique peut être trop laborieuse et dépasser la portée des expériences qui doivent rechercher rapidement des changements dans la formation de synapses.

DetectSyn est une application spécifique du test de ligature de proximité Duolink. Le test PLA permet la détection générale des interactions protéine-protéine. DetectSyn relie les mesures postsynaptiques proxy en amplifiant un signal fluorescent émis par des protéines pré- et postsynaptiques marquées à moins de 40 nm les unes des autres. Si les protéines synaptiques sont à moins de 40 nm, comme dans une fente synaptique, alors les anticorps secondaires, qui contiennent des sondes d’ADN, s’hybrideront en ADN circulaire. Cet ADN circulaire hybridé exprime une sonde fluorescente, qui est ensuite amplifiée et détectée avec des techniques de microscopie fluorescente standard (voir figure 1). Fondamentalement, contrairement à la TOMOGRAPHIE PAR ET À LA TOMOGRAPHIE PAR RÉSEAU, cette technique ne nécessite pas d’équipement spécialisé et prend à peu près le même temps que l’immunohistochimie standard. L’accessibilité de cette technique permet donc aux chercheurs en dehors des institutions à forte intensité de recherche de participer à la recherche en synaptopathologie. En outre, cette technique peut examiner les changements de densité synaptique dans plusieurs régions du cerveau au sein d’une seule expérience, offrant une représentation plus holistique des changements synaptiques dus à la maladie ou au traitement.

Protocol

L’isolement des cellules et des tissus des animaux était conforme au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health et approuvé par le Wake Forest Institutional Animal Care and Use Committee REMARQUE: Ce protocole est utilisé sur des échantillons déjà traités et fixés selon des paradigmes et des exigences expérimentaux spécifiques. À des fins de démonstration, la formation de synapses due à un traitement antidépresseur rapide …

Representative Results

Les données modifiées à partir de Heaney et al.6 sont présentées pour démontrer une expérience où l’on s’attend à une formation accrue de synapses (voir6 pour plus d’informations et une discussion plus approfondie du mécanisme). Auparavant, il a été démontré que les antidépresseurs rapides nécessitent l’activation du récepteur métabotropique inhibiteur, gabab (acide gamma-aminobutyrique sous-type B), pour êtreefficaces 13. …

Discussion

DetectSyn est un test rapide qui utilise un test de ligature de proximité pour détecter les protéines à moins de 40 nm les unes des autres, ce qui permet de détecter la formation de synapses. Cette technique améliore les tests fluorescents actuels, qui ne servent que de mesures indirectes pour la formation de synapses. DetectSyn détecte des changements quantifiables dans les protéines synaptiques localisées à moins de 40 nm, c’est-à-dire dans la fente synaptique, les unes des autres. En outre, DetectSyn est …

Materials

10x PBS	Fisher Scientific	BP39920	PBS made in house works, as well.
24 well plates	Fisher Scientific	FB012929	For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary.
50 mL conical tubes	Fisher Scientific	14-432-22
Aluminium foil	Fisher Scientific	15-078-290
Chicken anti-MAP2 antibody	Abcam	ab5392
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Other clear nail polish works, as well.
Cold block	Fisher Scientific	13131012
Computer workstation	HP
Confocal or fluorescent microscope	Nikon	A1R HD25
Donkey anti-chicken FITC	Fisher Scientific	SA1-72000
Duolink donkey anti-Mouse PLUS	Sigma	DUO92001
Duolink donkey anti-Rabbit MINUS	Sigma	DUO92005
Duolink In Situ Detection Reagents Far Red	Sigma	DUO92013	Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase.
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma	DUO82040
Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence	Sigma	DUO82049	Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B.
Fine-tipped paintbrush	Fisher Scientific	NC9691026	Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores
Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12545MP	Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	1255015	For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary.
Freezer, -20°C	VWR	76449-108
Glass coverslips	Fisher Scientific	125480
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Image processing software	e.g. NIS Elements, ImageJ
Incubator	Fisher Scientific	15-015-2633
Large petri dish, 100mm	Fisher Scientific	FB0875712
Molecular grade water	Fisher Scientific	BP24701
Mouse anti-Synapsin1 antibody	Synaptic Systems	106-011
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Orbital shaker	Fisher Scientific	02-106-1013
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-10
Pipette tips	Fisher Scientific	02-707-025
Pipettes	Fisher Scientific	14-388-100	Working volumes range from 3 µL to 500 µL
Plastic pasteur pipette	Fisher Scientific	02-708-006
Precision tweezers/foreceps	Fisher Scientific	12-000-122
Rabbit anti-PSD95 antibody	Abcam	ab18258	Other antibody pairs may work, as well, with optimization.
Refrigerator	VWR	76470-402
Small petri dish, 60 mm	Fisher Scientific	FB0875713A
Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100