DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법
Summary
DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸친 상대적 시냅스 (시냅스 전 및 시냅스 후 참여) 수의 변화를 측정하는 편향되지 않은 신속한 형광 분석법입니다. 이 기술은 배양된 뉴런 및 고정 조직 모두에서 사용될 수 있는 근접 라이게이션 기술을 이용한다.
Abstract
시냅스는 뉴런 사이의 통신 부위입니다. 신경 회로 강도는 시냅스 밀도와 관련이 있으며, 시냅스의 분해는 주요 우울 장애 (MDD) 및 알츠하이머 병과 같은 질병 상태의 특징입니다. 시냅스 수를 조사하기 위한 전통적인 기술에는 형광 마커(예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP))의 유전적 발현, 뉴런을 채우는 염료(예를 들어, 카르보시아닌 염료, DiI), 및 척추 마커의 면역형광 검출(예를 들어, 시냅스 후 밀도 95(PSD95))이 포함된다. 이러한 프록시 기술에 대한 주요 경고는 시냅스 후 변경 사항 만 식별한다는 것입니다. 그러나 시냅스는 시냅스 전 말단과 시냅스 후 척추 사이의 연결입니다. 시냅스 형성/제거를 측정하기 위한 황금 표준은 시간이 많이 소요되는 전자 현미경 또는 어레이 단층 촬영 기술이 필요합니다. 이러한 기술에는 전문 교육과 값 비싼 장비가 필요합니다. 또한, 제한된 수의 뉴런 만 평가할 수 있으며 전체 뇌 영역의 변화를 나타내는 데 사용됩니다. DetectSyn은 질병 상태 또는 약물 활동으로 인한 시냅스 형성 또는 제거의 변화를 식별하는 신속한 형광 기술입니다. DetectSyn은 신속한 근접 결찰 분석을 사용하여 병치된 시냅스 전후 단백질과 표준 형광 현미경을 검출하며, 이는 대부분의 실험실에서 쉽게 사용할 수 있는 기술입니다. 결과 누자의 형광 검출은 실험의 신속하고 편향되지 않은 분석을 가능하게합니다. DetectSyn은 제한된 수의 형광 뉴런보다 더 큰 영역을 분석 할 수 있기 때문에 전자 현미경보다 더 대표적인 결과를 제공합니다. 또한, DetectSyn은 시험관 내에서 배양된 뉴런 및 고정 조직 조각에 대해 작동합니다. 마지막으로, 이 기술로부터 수집된 데이터를 분석하는 방법이 제공된다. 전반적으로 DetectSyn은 치료 또는 질병 상태에 걸쳐 시냅스 밀도의 상대적 변화를 감지하는 절차를 제공하며 기존 기술보다 더 쉽게 접근 할 수 있습니다.
Introduction
시냅스는 뉴런 1 사이의 통신의 기본 단위입니다. 동일한 영역 내의 뉴런 사이의 많은 시냅스는 행동2를 매개하는 회로를 발생시킵니다. 시냅스는 다른 뉴런의 시냅스 후 수용체에 정보를 전달하는 신경 전달 물질 또는 신경 펩티드를 방출하는 하나의 뉴런에서 시냅스 전 말단으로 구성됩니다. 시냅스 전 신호의 합산은 시냅스 후 뉴런이 행동 잠재력을 발사하고 메시지를 다른 뉴런으로 전파할지 여부를 결정합니다.
시냅스의 분해 인 Synaptopathology는 알츠하이머 병 및 주요 우울 장애와 같은 신경 부피 감소로 인한 질병 및 장애에서 발생하며 더 이상 3,4,5를 최적으로 수행하지 않는 회로를 초래합니다. 시냅스 밀도를 복원하는 것은 이러한 장애에 대한 잠재적 인 치료법의 효능의 기초가 될 가능성이 큽니다. 예를 들어, 시냅스의 증가가 빠른 항우울제6의 행동 효능의 기초가 된다는 것이 최근에 입증되었다. 가능한 시냅스 병리학 치료를 신속하게 스크리닝하기 위해 연구자들은 시냅스 수의 변화를 신속하게 식별하는 기술이 필요합니다.
현재의 방법론은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들거나 (전자 현미경, 배열 단층 촬영), 시냅스 전 결합 (척추 분석, 면역 형광 / 공국소화)을 통합하지 않고 시냅스 후 변화 만 검사합니다. DiI와 같은 염료 또는 GFP와 같은 형광 단백질은 뉴런을 시각화하고 시냅스 후 척추를 특성화하는 데 도움이됩니다. 그러나 척추 분석은 연구자가 정의한 비율을 사용하여 형태학을 결정하며, 이는 재현성을 감소시킬 수 있습니다7. 또한, 상이한 척추 클래스가 기능적 시냅스와 어떻게 관련되는지는 여전히 밝혀지고 있다8. 척추 형성은 일시적일 수 있고 시냅스 후 가소성을 반영할 수 있지만, 이러한 척추는 시냅스 전 뉴런(9)을 갖는 시냅스로 안정화되기 전에 제거될 수 있다.
공국소화는 시냅스 전 및 시냅스 후 단백질에 대한 면역염색을 할 수 있기 때문에 척추 분석보다 시냅스에 대한 더 나은 프록시를 제공합니다. 그러나, 시냅스 단백질은 단백질이 병치되어 있고 일관되게 겹치지 않을 수 있기 때문에 낮은 공동국소화 값을 산출할 수 있다. 따라서, 단백질이 완전히 중첩되지 않기 때문에, 공동국재화 기술은 이러한 누락된 정보로 인한 시냅스 형성의 변화를 정확하게 측정하지 못할 수 있다. 마지막으로, 전자 현미경 (EM)과 어레이 단층 촬영 모두 시냅스의 고해상도 이미지를 제공하지만 시간이 많이 걸립니다. EM은 또한 전문 장비를 필요로하며, 연구원은 주어진 실험을 위해 소량의 조직으로 제한됩니다. 배열 단층 촬영은 초박형 절편에서 많은 단백질을 선별 할 수있는 기능을 우아하게 제공하고 EM10과 결합 할 수 있지만,이 기술은 너무 노동 집약적이며 시냅스 형성의 변화를 신속하게 스캔해야하는 실험 범위를 벗어날 수 있습니다.
DetectSyn은 Duolink 근접 결찰 분석의 특정 응용 프로그램입니다. PLA 분석은 단백질-단백질 상호작용의 일반적인 검출을 허용한다. DetectSyn 브릿지는 서로 40 nm 내에서 태그가 지정된 시냅스 전 및 시냅스 후 단백질에 의해 방출되는 형광 신호를 증폭하여 시냅스 후 측정을 브릿지합니다. 시냅스 단백질이 시냅스 구개열 내에서와 같이 40nm 이내에있는 경우, DNA 프로브를 포함하는 보조 항체는 원형 DNA로 혼성화됩니다. 이 혼성화된 원형 DNA는 형광 프로브를 발현하고, 이 프로브는 표준 형광 현미경 기술로 증폭 및 검출된다( 그림 1 참조). 결정적으로, EM 및 어레이 단층 촬영과는 달리,이 기술은 전문 장비를 필요로하지 않으며 표준 면역 조직 화학과 거의 동일한 시간이 걸립니다. 따라서이 기술의 접근성은 연구 집약적 인 기관 외부의 조사관이 시냅토 병리학 연구에 참여할 수있게합니다. 또한,이 기술은 단일 실험 내에서 여러 뇌 영역에서 시냅스 밀도의 변화를 조사 할 수 있으며, 질병 또는 치료로 인한 시냅스 변화의보다 전체적인 표현을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
DetectSyn은 근접 결찰 분석을 사용하여 서로 40nm 이내의 단백질을 검출하는 신속한 분석으로, 시냅스 형성을 검출 할 수 있습니다. 이 기술은 시냅스 형성을위한 프록시 측정만으로 사용되는 현재의 형광 분석을 향상시킵니다. DetectSyn은 40 nm 이내, 즉 시냅스 구개열 내에서 국소화된 시냅스 단백질의 정량화 가능한 변화를 검출한다. 또한 DetectSyn은 시냅스를 측정하고 고전적으로 금 표준 기술로 지?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원 NINDS R01 NS105005 (KRG) 및 NS105005-03S1 (KRG), 국방부 USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), FRAXA 연구 (CFH) 및 알츠하이머 협회 AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG)의 보조금을 지원했습니다.
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
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