DetectSyn: Synapse घनत्व में परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक त्वरित, निष्पक्ष फ्लोरोसेंट विधि
Summary
DetectSyn एक निष्पक्ष, तेजी से फ्लोरोसेंट परख है कि उपचार या रोग राज्यों भर में रिश्तेदार synapse (पूर्व और postsynaptic सगाई) संख्या में परिवर्तन को मापता है. यह तकनीक एक निकटता बंधन तकनीक का उपयोग करती है जिसका उपयोग सुसंस्कृत न्यूरॉन्स और निश्चित ऊतक दोनों में किया जा सकता है।
Abstract
Synapses न्यूरॉन्स के बीच संचार की साइट हैं। न्यूरोनल सर्किट ताकत सिनैप्टिक घनत्व से संबंधित है, और synapses का टूटना प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार (एमडीडी) और अल्जाइमर रोग जैसे रोग राज्यों की विशेषता है। Synapse संख्याओं की जांच करने के लिए पारंपरिक तकनीकों में फ्लोरोसेंट मार्करों की आनुवंशिक अभिव्यक्ति (उदाहरण के लिए, हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP)), रंजक जो एक न्यूरॉन (जैसे, कार्बोसाइनिन डाई, DiI) को भरते हैं, और रीढ़ मार्करों का इम्यूनोफ्लोरोसेंट डिटेक्शन (उदाहरण के लिए, पोस्टसिनेप्टिक घनत्व 95 (PSD95)) शामिल हैं। इन प्रॉक्सी तकनीकों के लिए एक प्रमुख चेतावनी यह है कि वे केवल पोस्टसिनेप्टिक परिवर्तनों की पहचान करते हैं। फिर भी, एक synapse एक presynaptic टर्मिनल और एक postsynaptic रीढ़ के बीच एक कनेक्शन है। सिनैप्स गठन / उन्मूलन को मापने के लिए सोने के मानक को समय लेने वाली इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या सरणी टोमोग्राफी तकनीकों की आवश्यकता होती है। इन तकनीकों के लिए विशेष प्रशिक्षण और महंगे उपकरणों की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, केवल सीमित संख्या में न्यूरॉन्स का मूल्यांकन किया जा सकता है और इसका उपयोग पूरे मस्तिष्क क्षेत्र में परिवर्तनों का प्रतिनिधित्व करने के लिए किया जाता है। DetectSyn एक तेजी से फ्लोरोसेंट तकनीक है जो एक रोग की स्थिति या दवा गतिविधि के कारण synapse गठन या उन्मूलन में परिवर्तन की पहचान करती है। DetectSyn एक तेजी से निकटता बंधाव परख का उपयोग करता है juxtaposed पूर्व और postsynaptic प्रोटीन और मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का पता लगाने के लिए, एक तकनीक आसानी से सबसे प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध है. परिणामी puncta के फ्लोरोसेंट पता लगाने प्रयोगों के त्वरित और निष्पक्ष विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. DetectSyn इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में अधिक प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करता है क्योंकि फ्लोरोसेंट न्यूरॉन्स की सीमित संख्या की तुलना में बड़े क्षेत्रों का विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, DetectSyn इन विट्रो सुसंस्कृत न्यूरॉन्स और निश्चित ऊतक स्लाइस के लिए काम करता है। अंत में, इस तकनीक से एकत्र किए गए डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक विधि प्रदान की जाती है। कुल मिलाकर, DetectSyn उपचार या रोग राज्यों में synapse घनत्व में सापेक्ष परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक प्रक्रिया प्रदान करता है और पारंपरिक तकनीकों की तुलना में अधिक सुलभ है।
Introduction
Synapses न्यूरॉन्स1 के बीच संचार की मौलिक इकाई हैं। एक ही क्षेत्र के भीतर न्यूरॉन्स के बीच कई synapses सर्किट है कि मध्यस्थता व्यवहार2 को जन्म देते हैं. Synapses एक न्यूरॉन से एक presynaptic टर्मिनल से मिलकर बनता है जो न्यूरोट्रांसमीटर या न्यूरोपेप्टाइड्स जारी करता है जो किसी अन्य न्यूरॉन के पोस्टसिनेप्टिक रिसेप्टर्स को जानकारी रिले करता है। प्रीसिनेप्टिक संकेतों का योग यह निर्धारित करता है कि क्या पोस्टसिनेप्टिक न्यूरॉन एक एक्शन पोटेंशियल को आग लगाएगा और संदेश को अन्य न्यूरॉन्स को प्रचारित करेगा।
Synaptopathology, synapses का टूटना, बीमारियों और विकारों में उत्पन्न होता है जो अल्जाइमर रोग और प्रमुख अवसादग्रस्तता विकार जैसे कम तंत्रिका मात्रा से चिह्नित होते हैं, जिसके परिणामस्वरूप सर्किट होते हैं जो अब 3,4,5 का प्रदर्शन नहीं करते हैं। Synapse घनत्व बहाल करने की संभावना इन विकारों के लिए संभावित उपचार की प्रभावकारिता underlies. उदाहरण के लिए, यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया था कि synapses में वृद्धि तेजी से antidepressants6 की व्यवहारिक प्रभावकारिता underlies. तेजी से संभव synaptopathology उपचार स्क्रीन करने के लिए, शोधकर्ताओं को तकनीकों की आवश्यकता होती है जो जल्दी से synapse संख्याओं में परिवर्तन की पहचान करते हैं।
वर्तमान तरीके या तो समय लेने वाली और महंगी हैं (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, सरणी टोमोग्राफी), या वे केवल प्रीसिनैप्टिक सगाई (रीढ़ का विश्लेषण, इम्यूनोफ्लोरेसेंस / कोलोकलाइजेशन) को शामिल किए बिना पोस्टसिनेप्टिक परिवर्तनों की जांच करते हैं। डीआईआई या जीएफपी जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन जैसे रंजक न्यूरॉन्स की कल्पना करने में मदद करते हैं और पोस्टसिनेप्टिक स्पाइन को चिह्नित करते हैं। हालांकि, रीढ़ का विश्लेषण आकृति विज्ञान को निर्धारित करने के लिए शोधकर्ता-परिभाषित अनुपात का उपयोग करता है, जो पुनरुत्पादन क्षमता को कम कर सकताहै 7। इसके अलावा, विभिन्न रीढ़ की हड्डी कक्षाएं कार्यात्मक synapses से कैसे संबंधित हैं, यह अभी भी उजागर किया जा रहा है8। रीढ़ की हड्डी का गठन क्षणिक हो सकता है और पोस्टसिनेप्टिक प्लास्टिसिटी को प्रतिबिंबित कर सकता है, लेकिन इन रीढ़ को प्रीसिनैप्टिक न्यूरॉन 9 के साथ एक सिनैप्स में स्थिर करने से पहले समाप्त किया जा सकताहै।
Colocalization रीढ़ की हड्डी के विश्लेषण की तुलना में synapses के लिए एक बेहतर प्रॉक्सी प्रदान करता है क्योंकि कोई भी प्रीसिनेप्टिक और पोस्टसिनेप्टिक प्रोटीन के लिए immunostain कर सकता है। हालांकि, सिनैप्टिक प्रोटीन कम कोलोकलाइजेशन मूल्यों को उत्पन्न कर सकते हैं क्योंकि प्रोटीन जुदा होता है और लगातार ओवरलैप नहीं हो सकता है। इस प्रकार, क्योंकि प्रोटीन पूरी तरह से अतिरंजित नहीं हैं, इसलिए कोलोकलाइजेशन तकनीकइस लापता जानकारी के कारण सिनैप्स गठन में परिवर्तनों को सटीक रूप से माप नहीं सकती है। अंत में, हालांकि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) और सरणी टोमोग्राफी दोनों synapses की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करते हैं, वे समय लेने वाले हैं। ईएम को आगे विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है, और शोधकर्ता किसी भी दिए गए प्रयोग के लिए ऊतक की छोटी मात्रा तक सीमित होते हैं। जबकि सरणी टोमोग्राफी सुरुचिपूर्ण रूप से अल्ट्राथिन वर्गों पर कई प्रोटीनों के लिए स्क्रीन करने की क्षमता प्रदान करती है और ईएम10 के साथ संयुक्त की जा सकती है, यह तकनीक बहुत श्रम-गहन और प्रयोगों के दायरे से परे हो सकती है जिन्हें सिनैप्स गठन में परिवर्तन के लिए तेजी से स्कैन करने की आवश्यकता होती है।
DetectSyn Duolink निकटता बंधाव परख का एक विशिष्ट आवेदन है. पीएलए परख प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का सामान्य पता लगाने के लिए अनुमति देता है। डिटेक्टसिन पुलों प्रॉक्सी postsynaptic उपायों को एक दूसरे के 40 एनएम के भीतर टैग पूर्व और postsynaptic प्रोटीन टैग द्वारा उत्सर्जित एक फ्लोरोसेंट संकेत को बढ़ाने के द्वारा उपायों. यदि सिनैप्टिक प्रोटीन 40 एनएम के भीतर हैं, जैसा कि एक सिनैप्टिक फांक के भीतर है, तो द्वितीयक एंटीबॉडी, जिसमें डीएनए जांच होती है, परिपत्र डीएनए में संकरित हो जाएगी। यह संकरित परिपत्र डीएनए एक फ्लोरोसेंट जांच को व्यक्त करता है, जिसे तब मानक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी तकनीकों के साथ प्रवर्धित और पता लगाया जाता है ( चित्रा 1 देखें)। महत्वपूर्ण रूप से, ईएम और सरणी टोमोग्राफी के विपरीत, इस तकनीक को विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं होती है और मानक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के समान समय लगता है। इस तकनीक की पहुंच, इस प्रकार, अनुसंधान-गहन संस्थानों के बाहर के जांचकर्ताओं को सिनैप्टोपैथोलॉजी अनुसंधान में भाग लेने में सक्षम बनाती है। इसके अलावा, यह तकनीक एक ही प्रयोग के भीतर कई मस्तिष्क क्षेत्रों में सिनैप्टिक घनत्व में परिवर्तन की जांच कर सकती है, जो बीमारी या उपचार के कारण सिनैप्टिक परिवर्तनों का अधिक समग्र प्रतिनिधित्व प्रदान करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
DetectSyn एक तेजी से परख है कि एक निकटता बंधाव परख का उपयोग करता है एक दूसरे के 40 एनएम के भीतर प्रोटीन का पता लगाने के लिए, जो synapse गठन का पता लगाने के लिए अनुमति देता है के भीतर प्रोटीन का पता लगाने के लिए है. यह तकन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान NINDS R01 NS105005 (KRG) और NS105005-03S1 (KRG), रक्षा विभाग USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH) और FRAXA-201 से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
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