DetectSyn: En snabb, opartisk fluorescerande metod för att upptäcka förändringar i synapsdensitet
Summary
DetectSyn är en opartisk, snabb fluorescerande analys som mäter förändringar i relativt synapsantal (pre- och postsynaptiskt engagemang) över behandlingar eller sjukdomstillstånd. Denna teknik använder en närhetsligeringsteknik som kan användas både i odlade neuroner och fast vävnad.
Abstract
Synapser är platsen för kommunikation mellan neuroner. Neuronal kretsstyrka är relaterad till synaptisk densitet, och nedbrytningen av synapser är karakteristisk för sjukdomstillstånd som egentlig depression (MDD) och Alzheimers sjukdom. Traditionella tekniker för att undersöka synapsnummer inkluderar genetiskt uttryck av fluorescerande markörer (t.ex. grönt fluorescerande protein (GFP)), färgämnen som fyller en neuron (t.ex. karbocyaninfärgämne, DiI) och immunofluorescerande detektion av ryggradsmarkörer (t.ex. postsynaptisk densitet 95 (PSD95)). En viktig varning för dessa proxytekniker är att de bara identifierar postsynaptiska förändringar. Ändå är en synaps en koppling mellan en presynaptisk terminal och en postsynaptisk ryggrad. Guldstandarden för mätning av synapsbildning/eliminering kräver tidskrävande elektronmikroskopi eller arraytomografitekniker. Dessa tekniker kräver specialutbildning och kostsam utrustning. Vidare kan endast ett begränsat antal nervceller bedömas och används för att representera förändringar i en hel hjärnregion. DetectSyn är en snabb fluorescerande teknik som identifierar förändringar i synapsbildning eller eliminering på grund av ett sjukdomstillstånd eller läkemedelsaktivitet. DetectSyn använder en snabb närhetsligeringsanalys för att upptäcka bredvid varandra pre- och postsynaptiska proteiner och standard fluorescerande mikroskopi, en teknik som är lätt tillgänglig för de flesta laboratorier. Fluorescerande detektion av den resulterande puncta möjliggör snabb och opartisk analys av experiment. DetectSyn ger mer representativa resultat än elektronmikroskopi eftersom större områden kan analyseras än ett begränsat antal fluorescerande nervceller. Dessutom fungerar DetectSyn för in vitro-odlade nervceller och fasta vävnadsskivor. Slutligen tillhandahålls en metod för att analysera data som samlats in från denna teknik. Sammantaget erbjuder DetectSyn ett förfarande för att upptäcka relativa förändringar i synapstäthet över behandlingar eller sjukdomstillstånd och är mer tillgängligt än traditionella tekniker.
Introduction
Synapser är den grundläggande enheten för kommunikation mellan neuroner1. Många synapser mellan neuroner inom samma regioner ger upphov till kretsar som förmedlar beteende2. Synapser består av en presynaptisk terminal från en neuron som frigör neurotransmittorer eller neuropeptider som vidarebefordrar information till postsynaptiska receptorer hos en annan neuron. Summeringen av presynaptiska signaler avgör om den postsynaptiska neuronen kommer att avfyra en åtgärdspotential och sprida meddelandet till andra neuroner.
Synaptopatologi, nedbrytningen av synapser, uppstår i sjukdomar och störningar som kännetecknas av minskad neural volym, som Alzheimers sjukdom och egentlig depression, vilket resulterar i kretsar som inte längre optimalt utför 3,4,5. Att återställa synapstätheten ligger sannolikt till grund för effekten av potentiella behandlingar för dessa störningar. Till exempel visades det nyligen att ökande synapser ligger till grund för beteendeeffekten av snabba antidepressiva medel6. För att snabbt screena möjliga synaptopatologiska behandlingar kräver forskare tekniker som snabbt identifierar förändringar i synapsnummer.
Nuvarande metoder är antingen tidskrävande och dyra (elektronmikroskopi, arraytomografi), eller så undersöker de bara postsynaptiska förändringar utan att införliva presynaptiskt engagemang (ryggradsanalyser, immunofluorescens / kolokalisering). Färgämnen som DiI eller fluorescerande proteiner som GFP hjälper till att visualisera nervceller och karakterisera postsynaptiska ryggar. Ryggradsanalys använder dock forskardefinierade förhållanden för att bestämma morfologi, vilket kan minska reproducerbarheten7. Vidare avslöjas fortfarande hur de olika ryggradsklasserna relaterar till funktionella synapser8. Ryggradsbildning kan vara övergående och kan återspegla postsynaptisk plasticitet, men dessa ryggar kan elimineras innan de stabiliseras till en synaps med en presynaptisk neuron9.
Kolokalisering ger en bättre proxy för synapser än ryggradsanalys eftersom man kan immunfärga för presynaptiska och postsynaptiska proteiner. Synaptiska proteiner kan emellertid ge låga samlokaliseringsvärden eftersom proteinerna ligger bredvid varandra och kanske inte konsekvent överlappar varandra. Således, eftersom proteinerna inte är helt överlagrade, kan samlokaliseringstekniker inte exakt mäta förändringar i synapsbildning på grund av denna saknade information. Slutligen, även om både elektronmikroskopi (EM) och arraytomografi ger högupplösta bilder av synapser, är de tidskrävande. EM kräver vidare specialutrustning, och forskare är begränsade till små volymer vävnad för ett visst experiment. Medan arraytomografi elegant ger möjlighet att screena för många proteiner på ultratunna sektioner och kan kombineras med EM10, kan denna teknik vara för arbetsintensiv och utanför ramen för experiment som snabbt måste skanna efter förändringar i synapsbildning.
DetectSyn är en specifik tillämpning av Duolink Proximity Ligation Assay. PLA-analysen möjliggör allmän detektion av protein-proteininteraktioner. DetectSyn överbryggar proxy postsynaptiska åtgärder genom att förstärka en fluorescerande signal som emitteras av taggade pre- och postsynaptiska proteiner inom 40 nm från varandra. Om de synaptiska proteinerna ligger inom 40 nm, som i en synaptisk klyfta, kommer de sekundära antikropparna, som innehåller DNA-sonder, att hybridiseras till cirkulärt DNA. Detta hybridiserade cirkulära DNA uttrycker en fluorescerande sond, som sedan förstärks och detekteras med standard fluorescerande mikroskopitekniker (se figur 1). Avgörande, till skillnad från EM och arraytomografi, kräver denna teknik inte specialutrustning och tar ungefär lika lång tid som standardimmunhistokemi. Tillgängligheten av denna teknik gör det således möjligt för utredare utanför forskningsintensiva institutioner att delta i synaptopatologisk forskning. Vidare kan denna teknik undersöka förändringar i synaptisk densitet i flera hjärnregioner inom ett enda experiment, vilket ger en mer holistisk representation av synaptiska förändringar på grund av sjukdom eller behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
DetectSyn är en snabb analys som använder en närhetsligeringsanalys för att detektera proteiner inom 40 nm från varandra, vilket möjliggör detektering av synapsbildning. Denna teknik förbättrar nuvarande fluorescerande analyser, som endast fungerar som proxymätningar för synapsbildning. DetectSyn detekterar kvantifierbara förändringar i synaptiska proteiner lokaliserade inom 40 nm, dvs inom den synaptiska klyftan, av varandra. Vidare är DetectSyn mer kostnadseffektivt och tar mindre tid än tekniker, som el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) och NS105005-03S1 (KRG), Department of Defense USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH) och ett bidrag från FRAXA Research (CFH) och Alzheimer’s Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
References
- Südhof, T. C. Towards an understanding of synapse formation. Neuron. 100 (2), 276-293 (2018).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 361 (6407), 31-39 (1993).
- Heaney, C. F., Raab-Graham, K. F. Dysregulated protein synthesis in major depressive disorder. The Oxford Handbook of Neuronal Protein Synthesis. , 510-532 (2018).
- Masliah, E., Crews, L., Hansen, L. Synaptic remodeling during aging and in Alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 9, 91-99 (2006).
- van Spronsen, M., Hoogenraad, C. C. Synapse pathology in psychiatric and neurologic disease. Current Neurology and Neuroscience Reports. 10 (3), 207-214 (2010).
- Heaney, C. F., Namjoshi, S. V., Uneri, A., Bach, E. C., Weiner, J. L., Raab-Graham, K. F. Role of FMRP in rapid antidepressant effects and synapse regulation. Molecular Psychiatry. 26 (6), 2350-2362 (2021).
- Pchitskaya, E., Bezprozvanny, I. Dendritic spines shape analysis-Classification or clusterization? Perspective. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 31 (2020).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 79-97 (2007).
- Berry, K. P., Nedivi, E. Spine Dynamics: Are they all the same. Neuron. 96 (1), 43-55 (2017).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: A new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Workman, E. R., Niere, F., Raab-Graham, K. F. mTORC1-dependent protein synthesis underlying rapid antidepressant effect requires GABABR signaling. Neuropharmacology. 73, 192-203 (2013).
- Li, N., et al. mTOR-dependent synapse formation underlies the rapid antidepressant effects of NMDA antagonists. Science. 329 (5994), 959-964 (2010).
