DetectSyn: un metodo fluorescente rapido e imparziale per rilevare i cambiamenti nella densità delle sinapsi
Summary
DetectSyn è un saggio fluorescente rapido e imparziale che misura i cambiamenti nel numero relativo di sinapsi (impegno pre e postsinaptico) tra trattamenti o stati patologici. Questa tecnica utilizza una tecnica di legatura di prossimità che può essere utilizzata sia nei neuroni in coltura che nei tessuti fissi.
Abstract
Le sinapsi sono il sito di comunicazione tra i neuroni. La forza del circuito neuronale è correlata alla densità sinaptica e la rottura delle sinapsi è caratteristica di stati patologici come il disturbo depressivo maggiore (MDD) e il morbo di Alzheimer. Le tecniche tradizionali per studiare il numero di sinapsi includono l’espressione genetica di marcatori fluorescenti (ad esempio, proteina fluorescente verde (GFP)), coloranti che riempiono un neurone (ad esempio, colorante carbocianine, DiI) e rilevamento immunofluorescente di marcatori spinali (ad esempio, densità postsinaptica 95 (PSD95)). Un avvertimento importante a queste tecniche proxy è che identificano solo i cambiamenti postsinaptici. Tuttavia, una sinapsi è una connessione tra un terminale presinaptico e una colonna vertebrale postsinaptica. Il gold standard per misurare la formazione / eliminazione delle sinapsi richiede tecniche di microscopia elettronica o tomografia array che richiedono tempo. Queste tecniche richiedono una formazione specializzata e attrezzature costose. Inoltre, solo un numero limitato di neuroni può essere valutato e viene utilizzato per rappresentare i cambiamenti in un’intera regione del cervello. DetectSyn è una tecnica fluorescente rapida che identifica i cambiamenti nella formazione o nell’eliminazione delle sinapsi a causa di uno stato di malattia o di un’attività farmacologica. DetectSyn utilizza un test di legatura di prossimità rapida per rilevare proteine pre e postsinaptiche giustapposte e microscopia fluorescente standard, una tecnica prontamente disponibile per la maggior parte dei laboratori. Il rilevamento fluorescente del puncta risultante consente un’analisi rapida e imparziale degli esperimenti. DetectSyn fornisce risultati più rappresentativi rispetto alla microscopia elettronica perché è possibile analizzare aree più grandi rispetto a un numero limitato di neuroni fluorescenti. Inoltre, DetectSyn funziona per neuroni in coltura in vitro e fette di tessuto fisse. Infine, viene fornito un metodo per analizzare i dati raccolti da questa tecnica. Nel complesso, DetectSyn offre una procedura per rilevare i cambiamenti relativi nella densità delle sinapsi tra trattamenti o stati patologici ed è più accessibile rispetto alle tecniche tradizionali.
Introduction
Le sinapsi sono l’unità fondamentale della comunicazione tra i neuroni1. Molte sinapsi tra neuroni all’interno delle stesse regioni danno origine a circuiti che mediano il comportamento2. Le sinapsi sono costituite da un terminale presinaptico di un neurone che rilascia neurotrasmettitori o neuropeptidi che trasmettono informazioni ai recettori postsinaptici di un altro neurone. La somma dei segnali presinaptici determina se il neurone postsinaptico attiverà un potenziale d’azione e propagherà il messaggio ad altri neuroni.
La sinaptopatologia, la rottura delle sinapsi, si manifesta in malattie e disturbi caratterizzati da diminuzione del volume neurale, come il morbo di Alzheimer e il disturbo depressivo maggiore, con conseguente circuiti che non funzionano più in modo ottimale 3,4,5. Il ripristino della densità delle sinapsi probabilmente è alla base dell’efficacia dei potenziali trattamenti per questi disturbi. Ad esempio, è stato recentemente dimostrato che l’aumento delle sinapsi è alla base dell’efficacia comportamentale degli antidepressivi rapidi6. Per esaminare rapidamente possibili trattamenti sinaptopatologici, i ricercatori richiedono tecniche che identifichino rapidamente i cambiamenti nei numeri delle sinapsi.
Le metodologie attuali sono lunghe e costose (microscopia elettronica, tomografia ad array), oppure esaminano solo i cambiamenti postsinaptici senza incorporare l’impegno presinaptico (analisi della colonna vertebrale, immunofluorescenza / colocalizzazione). Coloranti come DiI o proteine fluorescenti come GFP aiutano a visualizzare i neuroni e caratterizzano le spine postsinaptiche. Tuttavia, l’analisi della colonna vertebrale utilizza rapporti definiti dal ricercatore per determinare la morfologia, che può ridurre la riproducibilità7. Inoltre, il modo in cui le diverse classi della colonna vertebrale si riferiscono alle sinapsi funzionali è ancora in fase di scoperta8. La formazione della colonna vertebrale può essere transitoria e può riflettere la plasticità postsinaptica, ma queste spine potrebbero essere eliminate prima di stabilizzarsi in una sinapsi con un neurone presinaptico9.
La colocalizzazione fornisce un proxy migliore per le sinapsi rispetto all’analisi della colonna vertebrale perché si può immunostain per le proteine presinaptiche e postsinaptiche. Tuttavia, le proteine sinaptiche possono produrre bassi valori di colocalizzazione perché le proteine sono giustapposte e potrebbero non sovrapporsi in modo coerente. Pertanto, poiché le proteine non sono completamente sovrapposte, le tecniche di colocalizzazione potrebbero non misurare con precisione i cambiamenti nella formazione delle sinapsi a causa di queste informazioni mancanti. Infine, sebbene sia la microscopia elettronica (EM) che la tomografia array forniscano immagini ad alta risoluzione delle sinapsi, richiedono molto tempo. EM richiede inoltre attrezzature specializzate e i ricercatori sono limitati a piccoli volumi di tessuto per ogni dato esperimento. Mentre la tomografia ad array fornisce elegantemente la possibilità di selezionare molte proteine su sezioni ultrasottili e può essere combinata con EM10, questa tecnica può essere troppo laboriosa e al di là dello scopo degli esperimenti che devono eseguire rapidamente la scansione per i cambiamenti nella formazione delle sinapsi.
DetectSyn è un’applicazione specifica del Duolink Proximity Ligation Assay. Il test PLA consente la rilevazione generale delle interazioni proteina-proteina. DetectSyn collega le misure postsinaptiche proxy amplificando un segnale fluorescente emesso da proteine pre- e postsinaptiche taggate entro 40 nm l’una dall’altra. Se le proteine sinaptiche sono entro 40 nm, come all’interno di una fessura sinaptica, allora gli anticorpi secondari, che contengono sonde di DNA, si ibridano in DNA circolare. Questo DNA circolare ibridato esprime una sonda fluorescente, che viene poi amplificata e rilevata con tecniche standard di microscopia fluorescente (vedi Figura 1). Fondamentalmente, a differenza della tomografia EM e array, questa tecnica non richiede attrezzature specializzate e richiede circa la stessa quantità di tempo dell’immunoistochimica standard. L’accessibilità di questa tecnica, quindi, consente ai ricercatori al di fuori delle istituzioni ad alta intensità di ricerca di partecipare alla ricerca sinaptopatologica. Inoltre, questa tecnica può esaminare i cambiamenti della densità sinaptica in più regioni del cervello all’interno di un singolo esperimento, offrendo una rappresentazione più olistica dei cambiamenti sinaptici dovuti a malattie o trattamenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
DetectSyn è un test rapido che utilizza un test di legatura di prossimità per rilevare proteine entro 40 nm l’una dall’altra, che consente il rilevamento della formazione di sinapsi. Questa tecnica migliora gli attuali saggi fluorescenti, che servono solo come misure proxy per la formazione delle sinapsi. DetectSyn rileva cambiamenti quantificabili nelle proteine sinaptiche localizzate entro 40 nm, cioè all’interno della fessura sinaptica, l’una dell’altra. Inoltre, DetectSyn è più conveniente e richiede meno tempo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health NINDS R01 NS105005 (KRG) e NS105005-03S1 (KRG), Department of Defense USAMRMC W81XWH-14-1-0061 (KRG), NIAAA R01AA016852, NIAAA T32AA007565 (CFH), e una sovvenzione da FRAXA Research (CFH) e Alzheimer’s Association, AARG-NTF-21-852843 (KRG), AARF-19-614794-RAPID (KRG).
Materials
| 10x PBS | Fisher Scientific | BP39920 | PBS made in house works, as well. |
| 24 well plates | Fisher Scientific | FB012929 | For tissue slices, pre-sterilized plates may be unnecessary. |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Aluminium foil | Fisher Scientific | 15-078-290 | |
| Chicken anti-MAP2 antibody | Abcam | ab5392 | |
| Clear nail polish | Fisher Scientific | NC1849418 | Other clear nail polish works, as well. |
| Cold block | Fisher Scientific | 13131012 | |
| Computer workstation | HP | ||
| Confocal or fluorescent microscope | Nikon | A1R HD25 | |
| Donkey anti-chicken FITC | Fisher Scientific | SA1-72000 | |
| Duolink donkey anti-Mouse PLUS | Sigma | DUO92001 | |
| Duolink donkey anti-Rabbit MINUS | Sigma | DUO92005 | |
| Duolink In Situ Detection Reagents Far Red | Sigma | DUO92013 | Contains ligation stock, amplification stock, ligase, and polymerase. |
| Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI | Sigma | DUO82040 | |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma | DUO82049 | Contains Wash Buffer A and Wash Buffer B; dilute Wash Buffer B to 1% in diH20 for 1% Wash Buffer B. |
| Fine-tipped paintbrush | Fisher Scientific | NC9691026 | Sable hair, size 00 or 000, can also find at craft stores |
| Fisherbrand Cover Glasses: Rectangles | Fisher Scientific | 12545MP | Cover glass is unnecessary for cultured neurons already on glass coverslips. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 1255015 | For cultured neurons already on glass coverslips, Superfrost slides may be unnecessary. |
| Freezer, -20°C | VWR | 76449-108 | |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 125480 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Image processing software | e.g. NIS Elements, ImageJ | ||
| Incubator | Fisher Scientific | 15-015-2633 | |
| Large petri dish, 100mm | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Molecular grade water | Fisher Scientific | BP24701 | |
| Mouse anti-Synapsin1 antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 02-106-1013 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-025 | |
| Pipettes | Fisher Scientific | 14-388-100 | Working volumes range from 3 µL to 500 µL |
| Plastic pasteur pipette | Fisher Scientific | 02-708-006 | |
| Precision tweezers/foreceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
| Rabbit anti-PSD95 antibody | Abcam | ab18258 | Other antibody pairs may work, as well, with optimization. |
| Refrigerator | VWR | 76470-402 | |
| Small petri dish, 60 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| Timer | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 |
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