Bruke sanntidscelle metabolsk fluksanalysator for å overvåke osteoblastbioenergetikk

Summary

Sanntidscellemetabolisk fluksanalyse måler oksygenforbruket og ekstracellulær forsuringshastighet, som tilsvarer mitokondrie- og glykolytisk adenosin tripfosfatproduksjon, ved hjelp av pH- og oksygensensorer. Manuskriptet forklarer en metode for å forstå energistatusen til osteoblaster og karakterisering og tolkning av cellulær bioenergetisk status.

Abstract

Bendannelse av osteoblaster er en viktig prosess for riktig benanskaffelse og beinomsetning for å opprettholde skjelett homeostase, og til slutt forhindre brudd. I interesse for både å optimalisere topp benmasse og bekjempe ulike muskel- og skjelettsykdommer (dvs. post-menopausal osteoporose, anoreksi nervosa, type 1 og 2 diabetes mellitus), har det blitt gjort utrolige anstrengelser innen beinbiologi for å fullstendig karakterisere osteoblaster gjennom hele differensieringsprosessen. Gitt den primære rollen som modne osteoblaster å skille ut matriseproteiner og mineraliserings vesikler, har det blitt bemerket at disse prosessene tar en utrolig mengde cellulær energi, eller adenosin triphosfat (ATP). Den generelle cellulære energistatusen blir ofte referert til som cellulær bioenergi, og den inkluderer en rekke metabolske reaksjoner som registrerer substrattilgjengelighet for å utlede ATP for å møte cellulære behov. Derfor beskriver den nåværende metoden prosessen med å isolere primære, murine benmargsstromale celler (BMSCer) og overvåke deres bioenergetiske status ved hjelp av sanntidscellemetabolisk fluksanalysator på ulike stadier i osteoblastdifferensiering. Det er viktig at disse dataene har vist at den metabolske profilen endres dramatisk gjennom osteoblastdifferensiering. Dermed er det nødvendig å bruke denne fysiologisk relevante celletypen for å fullt ut sette pris på hvordan en celles bioenergetiske status kan regulere den generelle funksjonen.

Introduction

Dannelsen av bein av osteoblasten er ledsaget av koordinert ødeleggelse eller resorpsjon av bein av osteoklaster. Balansen mellom osteoblastisk bendannelse og osteoklast resorpsjon er en koblet prosess som beskriver beinomsetning eller ombygging, noe som er viktig for skjelett homeostase. Osteoblast dysfunksjon fører til nedsatt bendannelse og resulterer i ulike sykdommer, inkludert osteoporose ^1,2,3. Ex vivo/in vitro differensiering av benmargsstromale stamceller (BMSCer) til osteoblastforløpere og modne osteoblaster resulterer i dannelse og avsetning av den mineraliserte beinmatrisen i kulturfartøyet over tid ^4,5,6. Denne beindannelsen ved osteoblasten krever en betydelig mengde cellulær energi. Spesielt har kollagensyntese og sekresjon vist seg å stole sterkt på cellulær ATP: ADP-forhold, og antagelig krever mineralisert vesicle trafficking og sekresjon ytterligere ATP 7,8,9,10,11. Mange forskere har vist at prosessen med osteoblastogenese og osteoblastfunksjon krever tilstrekkelig tilførsel av energi for å møte den metabolske etterspørselen etter beindannelse 12,13,14,15,16. Derfor er målet med denne metoden å karakterisere den bioenergetiske statusen til primære, murine stromale celler gjennom osteoblastdifferensiering ved hjelp av sanntidscellemetabolisk fluksanalysator. Disse teknikkene bidrar til å utvikle en bedre forståelse av skjelett homeostase, noe som til slutt kan føre til utvikling av nye terapeutiske alternativer som er i stand til å forbedre skjelettsykdommer.

Sanntidscellemetabolismens fluksanalysator kan brukes til å måle oksygenforbruket (OCR) og ekstracellulær forsuringsrate (ECAR) av levende osteoblaster, som tilsvarer henholdsvis mitokondrie- og glykolytisk ATP-produksjon. Grunnleggende for denne metoden er det faktum at en H ⁺ ion per laktat frigjøres under glykolyse i konvertering av glukose til laktat, noe som endrer media pH reflektert i ECAR-verdiene. Motsatt, under TCA (trikarboksylsyre) syklus, oksidert fosforylering via mitokondriene produserer CO₂ ved å bruke eller konsumere oksygen, og derfor overvåking OCR reflekterer denne metabolske prosessen. Analysatoren måler både OCR og ECAR i det ekstracellulære mikromiljøet samtidig og i sanntid, noe som gir et enormt potensial når man studerer cellulær bioenergi ^6,17. I tillegg er det relativt enkelt å utføre disse analysene, avhengig av det eksperimentelle målet. Lignende teknikker har blitt brukt for å forstå T-celle metabolsk regulering av immunsystemet^18,19, kreftinitiering og progresjon²⁰, sammen med flere andre celletyper som bidrar til metabolske syndromer ^21,22.

Fordelene med sanntids metabolsk fluksanalysator over alternative teknikker inkluderer (1) evnen til å måle cellulær bioenergigetikk av levende celler i sanntid, (2) evne til å utføre analyser med et relativt lite antall celler (krever så lite som 5000 celler), (3) injeksjonsporter for å parallelt manipulere flere behandlinger i et 96-brønnssystem med høy gjennomstrømning, (4) bruk av radioaktiv etikettfri automatisert celleavbildning for normalisering^{18, 23,24}. Følgende metoder tar sikte på å gi en generalisert, men detaljert beskrivelse av overvåking av cellulær bioenergi i murine BMSCer gjennom osteoblastdifferensiering ved hjelp av analysatoren. Det vil inkludere rutinemessig utførte analyser; Men som med mange teknikker og metoder, er det sterkt oppmuntret at individuelle laboratorier bestemmer spesifikke detaljer for sine eksperimenter.

Utvalg av analyser og ulike typer analyser tilgjengelig: Et bredt utvalg av analysesett og reagenser er tilgjengelige for å studere bioenergien til celler samtidig som påliteligheten og konsistensen av de eksperimentelle resultatene sikres. I tillegg tilbyr skrivebordsprogramvaren også analysemaler som enkelt kan tilpasses. Analysen kan defineres basert på brukerens behov for å måle ulike metabolske parametere. Disse analysene kan endres på ulike måter basert på det eksperimentelle målet og/eller det vitenskapelige spørsmålet. For eksempel, med fire injeksjonsporter, kan flere forbindelser injiseres i analysemediet for å analysere den cellulære responsen som er spesifikk for hver metabolske bane.

Celleenergi fenotype test: Denne analysen måler levende cellers metabolske fenotype og metabolske potensial. Denne analysen anbefales også som det første trinnet for å få en generalisert ide om banespesifikk metabolisme. En blanding av oligomycin A-an-hemmer av ATP-syntase og Carbonylcyanid 4-(trifluorometoksy) fenylhydrazon (FCCP)-et mitokondrie-frakoblingsmiddel injiseres for å forstå celleenergipotensialet. Injeksjonen av oligomycin A hemmer syntesen av ATP, noe som resulterer i en økning i glykolysehastigheten (ECAR) for å gjøre det mulig for cellene å møte sine energibehov; På den annen side resulterer injeksjonen av FCCP i høyere OCR på grunn av depolarisering av mitokondriemembranen. I hovedsak skildrer denne analysen basal metabolsk åndedrett, og etter de doble injeksjonene, pressene eller stressene, den metabolske responsen. Basert på disse parametrene plotter programvaren deretter OCR og ECAR av cellene ved å klassifisere cellene som aerob, passiv, glykolytisk eller energisk tilstand over tid^25,26.

ATP-analyse i sanntidsproduksjonsrate: Dette måler den cellulære ATP-produksjonen samtidig fra glykolyse og mitokondrie respirasjon. Denne analysen måler kvantitativt de metabolske skiftene fra de to energiveiene og gir data om mitokondrie- og glykolytiske ATP-produksjonsrater over tid. Analysen innhenter basale OCR- og ECAR-data etterfulgt av beregning av mitokondrie-ATP-produksjonshastighet gjennom injeksjon av oligomycin A og glykolytisk ATP-produksjonshastighet gjennom injeksjon av rotenon + antimycin En blanding (total hemming av mitokondriefunksjon), noe som resulterer i mitokondrieforsuring^17,27.

Celle mitokondrier stress test (eller celle mitokon stress test): Dette måler mitokondriefunksjonen gjennom ATP-koblet respirasjon, kvantifiserer cellulær bioenergi, identifiserer mitokondrie dysfunksjon og måler cellenes respons på stress. Ulike parametere, inkludert basal og ekstra respiratorisk kapasitet, ATP-koblet åndedrett, maksimal respirasjon og ikke-mitokondrie oksygenforbruk, kan oppnås i en analyse. Denne analysen innebærer sekvensielle injeksjoner av oligomycin A, FCCP (mitokondrie-frakoblingsmiddel), en blanding av rotenon/antimycin A-hemmere for effektivt å analysere effekten av disse på mitokondriefunksjonen²⁸.

Fleksibilitet mito drivstoff flex test: Dette måler mitokondrie respirasjonshastigheten ved oksidasjon av de tre primære mitokondriebrenselene ved tilstedeværelse og fravær av deres inhibitorer. Den sekvensielle hemmingen av glukose, glutamin og fettsyrer hjelper til med å måle avhengigheten, kapasiteten og fleksibiliteten til celler og avhengigheten av cellene i ulike cellulære veier for å møte energibehovet. Når mitokondriene ikke kan oppfylle kravene til den blokkerte veien av interesse ved å oksidere andre drivstoff, går cellene inn i en avhengighetstilstand. Kapasiteten til cellene beregnes ved hemming av de to andre alternative banene etterfulgt av hemming av interesseveien. Fleksibiliteten til celler bidrar til å forstå mitokondrienes evne til å kompensere og møte drivstoffbehovene til den hemmede banen. Den beregnes ved å trekke avhengigheten av celler fra cellekapasiteten. Tre forskjellige hemmere brukes uavhengig eller som en blanding av to for effektivt å beregne analyseparametrene. 2-cyano-3-(1-fenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid (UK5099) hemmer oksidasjon av glukose ved å blokkere pyruvatbæreren i glykolyse. Bis-2-(5-fenylacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-yl) (BPTES) etylsulfid hemmer glutaminoksidasjonsveien, og etomoksir hemmer oksidasjon av langkjedede fettsyrer²⁹.

Figur 1: Skjematisk fremstilling av metodikken for dyrking og tilberedning av osteoblaster for analyse. Murine BMSC-er er isolert fra lange bein, dyrket og frøet i 96-brønnsplater ved 25 000 celler / brønntetthet. Kultivering av disse cellene i osteoblastspesifikke medier startes når de når 80% -100% samløp for å starte differensiering. Analysene utføres på forskjellige stadier av differensiering. Patronplatene er hydrert en dag før analysen. På analysedagen injiseres forskjellige inhibitorer i portene til sensorpatronene basert på analysekravene, og en kalibreringsbuffer legges til 96-brønns kalibreringsplaten. Etter kalibrering utføres sanntidscellemetabolismens fluksanalyse, etterfulgt av avbildning av cellekulturmikroplaten ved hjelp av mikroplateavbildningen for å normalisere sanntidscellemetaboliske fluksanalysatordata med celleantall. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle prosedyrene var basert på retningslinjer og godkjenning fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Vanderbilt University Medical Center. 1. Utarbeidelse av reagenser og analyseoppsett Isolering og dyrking av benmargstromale celler (se også forrige artikkel30). Forbered komplette alfa minimum essensielle medier (αMEM) cellekulturmedier ved å supplere minimum essensielle medier med alfa modifikasjon med 10% FBS (foster …

Representative Results

Figur 6: Representative grafer for rutinemessig utførte analyser for å forstå den cellulære bioenergetiske profilen til kontroll vs. behandlingsgruppe med sine respektive standardfeil. (A) Celleenergifenotype-testen. Plottet representerer glykolysen (ECAR) vs. mitokondrie respirasjon (OCR) av kontrollen vs. to behandlings…

Discussion

Sanntidscellemetabolisk fluksanalysator kan brukes til å utforske cellulære energiske under forskjellige forhold. Protokollen illustrerer effektiv isolering av BMSCer, fortykningsceller i passende cellekulturplater, og deres differensiering til modne osteoblaster, som kan brukes til ulike analyser ved hjelp av den ekstracellulære fluksanalysatoren. Videre forklares også de kritiske trinnene i sanntidscellemetabolisk fluksanalyse, inkludert hydrering av sensorpatroner, lasting av injeksjonsportene, utførelse av analy…

Materials

0.25% Trypsin EDTA	Sigma-Aldrich	T4049
2-cyano-3-(1-phenyl-1H-indol-3-yl)-2-propenoic acid	Sigma – Aldrich	PZ0160	UK5099
Antimycin A	Sigma – Aldrich	A8674
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544-100G
Bis-2-(5-phenylacetamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide	Sigma – Aldrich	SML0601	BPTES
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone	Sigma – Aldrich	C2920	FCCP
Cytation 5 imaging reader	BioTek	N/A	Microplate imager
Etomoxir sodium salt hydrate	Sigma – Aldrich	E1905
Hoechst 33342 Solution (20 mM)	Thermo Scientific	62249
Insulin	Sigma – Aldrich	I6634
Oleic Acid-Albumin from bovine serum	Sigma – Aldrich	O3008
Oligomycin A – 5 mg	Sigma – Aldrich	75351
Rotenone	Sigma – Aldrich	R8875-1G
Seahorse XF 1.0 M Glucose Solution	Agilent Technologies	103577-100
Seahorse XF 100mM Pyruvate Solution	Agilent Technologies	103578-100
Seahorse XF 200mM Glutamine solution	Agilent Technologies	103579-100
Seahorse XF DMEM media	Agilent Technologies	103575-100	DMEM assay media eith 5mM HEPES, pH 7.4, without phenol red, sodium bicarbonate, glucose, pyruvate, and L-glutamine
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent Technologies	S7800B	Real- Time Metabolic flux analyzer
Seahorse XFe96 FluxPak	Agilent Technologies	102416-100	Includes XFe96 Sensor cartridges, Cell culture microplates, and Seahorse XF Calibrant solution
The Cell imaging 1.1.0.11 software	Agilent Technologies – BioTek
Wave software 2.6.1	Agilent Technologies
β-glycerol phosphate	Sigma-Aldrich	G9422-50G