Summary
Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.
Abstract
De ontwikkeling en homeostase van meercellige organismen zijn afhankelijk van gecoördineerde regulatie van celmigratie. Celmigratie is een essentiële gebeurtenis in de constructie en regeneratie van weefsels en is van cruciaal belang voor de embryonale ontwikkeling, immunologische reacties en wondgenezing. Ontregeling van de celmotiliteit draagt bij aan pathologische aandoeningen, zoals chronische ontstekingen en kankermetastase. Celmigratie, weefselinvasie, axon- en dendrietuitgroei beginnen allemaal met actinepolymerisatie-gemedieerde celranduitsteeksels. Hier beschrijven we een eenvoudige, efficiënte, tijdbesparende methode voor de beeldvorming en kwantitatieve analyse van celranduitsteekseldynamiek tijdens het verspreiden. Deze methode meet discrete kenmerken van celrandmembraandynamica, zoals uitsteeksels, retracties en ruches, en kan worden gebruikt om te beoordelen hoe manipulaties van belangrijke actineregulatoren celranduitsteeksels in verschillende contexten beïnvloeden.
Introduction
Celmigratie is een kritisch proces dat de ontwikkeling en functie van alle levende organismen regelt. Celmigratie vindt plaats in zowel fysiologische omstandigheden, zoals embryogenese, wondgenezing en immuunrespons, als bij pathologische aandoeningen, zoals kankermetastase en auto-immuunziekte. Ondanks verschillen in celtypen die deelnemen aan verschillende migratiegebeurtenissen, delen alle celmotiliteitsgebeurtenissen vergelijkbare moleculaire mechanismen, die bewaard zijn gebleven in de evolutie van protozoa tot zoogdieren, en omvatten ze gemeenschappelijke cytoskeletale controlemechanismen die de omgeving kunnen detecteren, reageren op signalen en celgedrag in reactie kunnen moduleren1.
Een eerste fase in celmigratie kan de vorming van zeer dynamische uitsteeksels aan de voorrand van de cel zijn. Achter het lamellipodium bevindt zich de lamellen, die actine koppelt aan myosine II-gemedieerde contractiliteit en adhesie aan het onderliggende substraat bemiddelt. Lamellipodia worden geïnduceerd door extracellulaire stimuli zoals groeifactoren, cytokines en celadhesiereceptoren en worden aangedreven door actinepolymerisatie, die de fysieke kracht levert die het plasmamembraan naar voren duwt2,3. Veel signalerende en structurele eiwitten zijn hierbij betrokken; onder hen zijn Rho GTPases, die coördinerend werken met andere signalen om actine-regulerende eiwitten te activeren, zoals het Arp 2/3-complex, WASP-familie-eiwitten en leden van de Formin- en Spire-families in lamellipodia2,4,5.
Naast actinepolymerisatie is myosine II-activiteit vereist voor het genereren van contractiele krachten op het lamellipodium en de voorste lamellen. Deze samentrekkingen, ook gedefinieerd als celrandterugtrekkingen, kunnen ook het gevolg zijn van depolymerisatie van dendritische actine aan de celrand en zijn van cruciaal belang voor het ontwikkelen van de lamellipodiale voorrand en het uitsteeksel in staat stellen de flexibiliteit van de extracellulaire matrix en andere cellen te voelen en de migratierichting te bepalen6,7,8 . Uitsteeksels van de celrand die zich niet aan het substraat kunnen hechten, vormen perifere membraanruches, plaatachtige structuren die op het ventrale oppervlak van lamellipodia en lamellen verschijnen en achteruit bewegen ten opzichte van de migratierichting. Omdat het lamellipodium zich niet aan het substraat hecht, vormt zich eronder een achterste lamellipodium en duwt het eerste lamellipodium mechanisch naar het bovenste ventrale oppervlak. De actinefilamenten in de ruche die vroeger evenwijdig aan het substraat waren, komen er nu loodrecht op te staan en de ruche bevindt zich nu boven het oprukkende lamellipodium. De ruche die naar achteren beweegt, valt terug in het cytosol en vertegenwoordigt een cellulair mechanisme voor het recyclen van lamellipodiaal actine9,10.
Hier beschrijven we een test voor het meten van celrand uitsteekseldynamiek. De uitsteekseltest maakt gebruik van time-lapse videomicroscopie om gedurende 10 minuten tijdens de verspreidingsfase van de cel een enkele celrand uitsteekseldynamiek te meten. Uitsteekseldynamiek wordt geanalyseerd door kymografen uit deze films te genereren. In principe geeft een kymograaf gedetailleerde kwantitatieve gegevens van bewegende deeltjes in een spatiotemporale plot om een kwalitatief begrip van de celranddynamica te verkrijgen. De intensiteit van het bewegende deeltje wordt uitgezet voor alle beeldstapels in een tijd versus ruimte plot, waarbij de X-as en de Y-as respectievelijk tijd en afstand vertegenwoordigen11. Deze methode maakt gebruik van een handmatige kymograafanalyse met ImageJ om gedetailleerde kwantitatieve gegevens te verkrijgen, waardoor informatie uit films en afbeeldingen kan worden opgehaald in geval van een lage signaal-ruisverhouding en / of hoge functiedichtheid, en de analyse van afbeeldingen die zijn verkregen in fasecontrastlichtmicroscopie of slechte beeldkwaliteit.
De celrand uitsteekseldynamiektest die hierin wordt beschreven, is een snelle, eenvoudige en kosteneffectieve methode. Als zodanig, en omdat is aangetoond dat het direct correleert met celmigratie11,12, kan het worden gebruikt als een voorlopige methode voor het testen van cytoskeletale dynamica die betrokken is bij celmotiliteit voordat wordt besloten om meer middelen-veeleisende methoden uit te voeren. Bovendien maakt het ook kwantitatieve meting mogelijk van hoe genetische manipulaties (knock-out, knockdown of reddingsconstructies) van cytoskeletale eiwitten de cytoskeletale dynamiek beïnvloeden met behulp van een eenvoudig platform. De assay is een leerzaam model voor het onderzoeken van cytoskeletale dynamica in de context van celmigratie en kan worden gebruikt voor opheldering van de mechanismen en moleculen die ten grondslag liggen aan celmotiliteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle methoden die in dit protocol worden beschreven, zijn goedgekeurd door de institutionele Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Bar-Ilan University.
OPMERKING: Een stapsgewijze grafische weergave van de procedure die in deze sectie wordt beschreven, wordt weergegeven in figuur 1.
1. Celkweek
OPMERKING: De cellen die in het protocol worden gebruikt, zijn embryonale fibroblasten van muizen (MEF's) die zijn gegenereerd uit E11.5-13.5-embryo's van wild-type C57BL / 6-muizen. Primaire MEF's werden gegenereerd volgens het Jacks laboratoriumprotocol13. Cellen van vijf verschillende embryo's werden samengevoegd en vereeuwigd door infectie met een retrovirale vector die SV40 groot T-antigeen tot expressie bracht, gevolgd door selectie met 4 mM Histidinol gedurende 3 weken.
- Kweekcellen in weefselkweekplaten die Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bevatten met 1 g/L glucose, 1% glutamine, 1% penicilline-streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS) (zie Materialentabel), in een bevochtigde incubator met 5% CO2 bij 37 °C.
- Kweek de cellen tot 90% -95% confluentie en splits in een verhouding van 1: 5 elke 2-3 dagen.
2. Vaatcoating met glazen bodem
OPMERKING: De glasbodemcoating moet in steriele omstandigheden in de weefselkweekkap worden uitgevoerd.
- Voeg 2 ml 1N HCl-oplossing toe in het midden van een schaal met glazen bodem (Table of Materials) en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
OPMERKING: Deze fase is bedoeld om residu uit het glas te verwijderen dat de beeldvorming later kan onderbreken. - Was de schotel met glazen bodem drie keer met elk 2 ml 1x PBS (Table of Materials).
- Verdun fibronectine (zie materiaaltabel) tot 10 μg/ml in 1x PBS. Voeg 200 μL van de verdunde fibronectine-oplossing toe aan het glazen midden van de schaal. Incubeer bij 37 °C (weefselkweekincubator) gedurende 1 uur.
OPMERKING: Als alternatief kan de schotel met glazen bodem een nacht bij 4 °C op een vlakke ondergrond worden geïncubeerd. - Bereid tijdens de incubatietijd van de fibronectinecoating 1% BSA-oplossing (Table of Materials) in 1x PBS, filtreer door 0,2 μm en denature door gedurende 30 minuten te incuberen bij 70 °C in een voorverwarmd waterbad.
- Was de gecoate schotel met glazen bodem drie keer met elk 2 ml 1x PBS.
- Voeg 2 ml gedenatureerde BSA-oplossing toe aan het glascentrum en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C (weefselkweekincubator).
OPMERKING: Als alternatief kan de schotel met glazen bodem een nacht bij 4 °C op een vlakke ondergrond worden geïncubeerd. - Was de schotel met glazen bodem 3 keer met elk 2 ml 1x PBS.
OPMERKING: Incubatie van schalen met glazen bodem met fibronectine moet gedurende ten minste 1 uur bij 37 °C worden uitgevoerd om het oppervlak goed te coaten. Kortere incubatietijd kan niet de juiste coating produceren, en als gevolg daarvan is het celfenotype mogelijk niet gerelateerd aan integrine-activering. De BSA-laag is inert en heeft geen invloed op de uitsteekseldynamiek en is bedoeld om vrije potentiële locaties voor integrine-onafhankelijke celadhesie te blokkeren. De BSA moet vóór de coating worden gedenatureerd om te voorkomen dat het celapoptose induceert, wat de dynamiek van de celrand kan beïnvloeden.
3. Voorbereiding van cellen voor beeldvorming
- Zestien tot achttien uur voor het experiment bereiken de cellen de volgende dag 70% -80% confluentie. Voor MEF's, plaat 0,7 x 106 cellen per weefselkweekplaat met een diameter van 10 cm per dag voordat het experiment wordt uitgevoerd.
OPMERKING: Voor een succesvol uitsteekselexperiment is het belangrijk dat de cellen worden gebruikt tijdens hun logaritmische groeifase. Om dit te bereiken, moeten cellen 70% -80% samenvloeiing bereiken op de dag van het experiment. Een hogere dichtheid van cellen zal resulteren in een langere verspreidingstijd en/of belemmering van de hechting tijdens het experiment. - Voeg op de experimentele dag 2 ml trypsine-oplossing (materiaaltabel) toe per weefselkweekplaat met een diameter van 10 cm en incubeer gedurende 2-3 minuten in een weefselkweekincubator totdat de cellen loskomen. Inactiveer trypsine door 5 ml van het volledige medium toe te voegen.
- Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en plaats 20.000 cellen in 2 ml van het volledige medium op een schaal met glazen bodem zoals hierboven gecoat (sectie 2).
OPMERKING: Het aantal cellen voor plating is afhankelijk van de grootte en het type cellen. Voor grotere of meer verspreide cellen, plaat slechts 10.000 cellen om genoeg cellen te hebben voor beeldvorming. Het is belangrijk om afzonderlijke cellen te kiezen die elkaar niet raken, omdat cel-tot-celcontact het cel-intrinsieke verspreidingsgedrag kan veranderen. - Incubeer de schalen met glazen bodem met vergulde cellen in de weefselkweekincubator gedurende 15 minuten.
OPMERKING: Tijdens deze fase hechten cellen zich aan het fibronectinesubstraat en verspreiden zich erover. Bij het meten van uitsteeksels tijdens celverspreiding moeten cellen zich gedurende 15 minuten na plating en vóór beeldvorming kunnen verspreiden. Beeldvorming kan worden uitgevoerd binnen een tijdsvenster tussen 15 minuten tot ~ 1 uur na plating, en in elk geval voordat de cellen beginnen te migreren.
4. Microscoop instelling en beeldvorming
OPMERKING: Er zijn verschillende live-cell microscopiesystemen beschikbaar. Het systeem dat hier wordt gebruikt is een Leica AF6000 omgekeerde microscoop uitgerust met CO2 - en verwarmingseenheden en is bevestigd aan een ORCA-Flash 4.0 V2 digitale CMOS-camera.
- Zet de verwarmingseenheid ten minste 1 uur voor het afbeelden aan en stel deze in op 37 °C.
- Schakel de CO2-eenheid ten minste 10 minuten voor het afbeelden in en stel deze in op 5% CO2.
- Schakel de microscoop, camera en computer in.
- Open de microscoopacquisitiesoftware (zie Tabel met materialen). Kies de map om vastgelegde afbeeldingen op te slaan en typ een bestandsnaam. Sla elke film op als een nieuw bestand.
- Stel de vergroting in op een 40x droge lens, fasecontrast. Stel het tijdsinterval in op 5 s, totale filmduur 10 min.
- Na 15 minuten incubatie van de vergulde cellen plaatst u de schotel met glazen bodem met aangehechte cellen in de adapter en bevestigt u deze. Plaats de adapter met de schotel in de sleuf in het microscoopstadium.
- Haal het deksel van de schotel eraf en plaats in plaats daarvan het CO2-deksel . Open de CO2-klep .
OPMERKING: Zorg ervoor dat het CO2-deksel schoon is voordat u het op de glazen schaal plaatst. Een vuile hoes vermindert de kwaliteit van films. Veeg de onderkant van het CO2-deksel schoon met een pluisvrij doekje gedrenkt in 70% ethanol om stof en vuil te verwijderen. Veeg een tweede keer af met een droog pluisvrij doekje. - Bekijk de cellen en zoek een geschikte cel voor beeldvorming. Zorg ervoor dat de cel scherp is en begin met het aanschaffen van films.
5. Beeldanalyse
OPMERKING: Beeldanalyse wordt als volgt uitgevoerd met ImageJ (Table of Materials):
- Open de verworven film in ImageJ.
- Maak met het gereedschap Recht op de hoofdwerkbalk acht lijnen van 20 willekeurige eenheden die elk loodrecht staan op de uitsteeksels, inclusief de lamellen en de celrand, in een radiale opstelling om de 45°, zoals weergegeven in figuur 2A.
- Ga in de hoofdwerkbalk naar Afbeelding > stapels > Reslice. Dit levert een kymograafbeeld op, dat de beweging van enkele punten binnen het celmembraan beschrijft (figuur 2B). Deze actie moet voor elke regel van de acht regels afzonderlijk worden uitgevoerd.
- Extraheer en tel handmatig uit de respectieve kymograafafbeeldingen het aantal uitsteeksels, terugtrekkingen en ruches in elk van de acht regio's in de cel, gemarkeerd door de rasterlijnen. Deze getallen vertegenwoordigen de frequentie van uitsteeksels, terugtrekkingen en ruches per 10 minuten (figuur 2C, D).
OPMERKING: Ruches kunnen worden onderscheiden van andere structuren op basis van hun donkere uiterlijk in fasecontrastmicroscopie en hun centripetale beweging, die begint bij de celrand en eindigt aan de rand van het cellichaam, die kan worden waargenomen in de verworven films. Van belang is dat bij het kwantificeren van uitsteeksel, terugtrekking en ruchefrequentie films moeten worden waargenomen als een controle voor kwantificering en vooral voor het definiëren van ruches. - Bepaal de uitsteekselperistentie, afstand en snelheid door kymografie-analyse. Voor elk van de gegenereerde kymografen staat de X-as voor afstand en de Y-as voor tijd.
- Volg de stappen 5.6.1-5.6.2 om de uitsteekselafstand te meten.
- Teken een loodrechte lijn van de basis van het uitsteeksel naar de hoogste top van het uitsteeksel. Druk op M in ImageJ om de lengte van de lijn in pixels te meten.
- Als u de lengte van pixels naar μm wilt converteren, moet u ervoor zorgen dat de verhouding tussen pixel en μm bekend is.
OPMERKING: De μm-pixelverhouding is de fysieke lengte van een pixel op de CCD-camera / totale vergroting. De pixelgrootte is kenmerkend voor elk type camera. Voor de camera die in dit onderzoek wordt gebruikt, is de pixelgrootte bijvoorbeeld 6,5 μm x 6,5 μm, de fysieke lengte 6,5 μm en de vergroting die we gebruikten is 40x. Daarom is de μm-pixelverhouding van onze camera 0,1625 μm/pixel. In de analyse zou voor een lijn in de lengte van 30 pixels de uitsteekselafstand 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm zijn (figuur 3).
- Om de uitsteekseltijd (persistentie; de hoeveelheid tijd die een uitsteeksel doorbrengt voordat het wordt ingetrokken) te meten, volgt u de stappen 5.7.1-5.7.2.
- Teken een horizontale lijn van het begin van het uitsteeksel (van links naar rechts) naar het gebied van de hoogste piek. Druk op M in ImageJ om de lengte van de lijn in pixels te meten.
- Als u de lengte van pixels naar minuten wilt converteren, berekent u de verhouding tussen pixel en min. Deze waarde is afhankelijk van het interval tussen afbeeldingen.
OPMERKING: In dit voorbeeld is het interval tussen afbeeldingen 5 s, de min/pixelverhouding 0,0833 en de horizontale lijnlengte 8 pixels. Daarom is de uitsteekseltijd 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min.
- Meet en bereken de retractietijd op dezelfde manier als de uitsteekseltijd voor een lijn die horizontaal is getekend aan de basis van het uitsteeksel van waaruit de piek van het uitsteeksel zich naar de basis aan de rechterkant bevindt (lijn X2 in figuur 3).
- Bereken de uitsteekselsnelheid door de uitsteekselafstand te delen door de uitsteekseltijd. Bereken de retractiesnelheid door de uitsteekselafstand te delen door de retractietijd. In dit voorbeeld wordt de uitsteekselsnelheid berekend als 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., en de retractiesnelheid is identiek omdat de lijn die de tijd vertegenwoordigt op dezelfde lengte is.
OPMERKING: Bij het vergelijken van verschillende celtypen, d.w.z. cellen die wildtype en mutante constructies van hetzelfde eiwit tot expressie brengen, is het noodzakelijk om een geblindeerde analyse uit te voeren, zodat er geen vertekening wordt geïntroduceerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In het experiment beschreven in figuur 2 werden vereeuwigde MEF's verguld op schotels met glazen bodem voorgecoat met fibronectine om integrine-gemedieerde signalering te activeren, geblokkeerd door gedenatureerd BSA, om vrije potentiële locaties voor celadhesie te blokkeren die niet afhankelijk is van integrine-activering. Om de logaritmische groeifase te bereiken bij 70%-80% samenvloeiing van cellen op de dag van het experiment, werden 0,7 x 106 MEF's 16 uur voor het experiment in een weefselkweekplaat met een diameter van 10 cm geplateerd. Op de experimentele dag werden cellen trypsine-ge trypsineiseerd en geteld, en 20.000 cellen werden verguld op een fibronectine / BSA-gecoate schotel met glazen bodem. De schotel werd gedurende 15 minuten geïncubeerd bij 37 °C om aanhechting en verspreiding van de cellen mogelijk te maken voordat de beeldvorming plaatsvond. Na incubatie werd de plaat in een microscoopincubatorkamer geplaatst (37 °C, 5% CO2) en werden afzonderlijke cellen in beeld gebracht met behulp van een 40x droge lens in faselicht. Beeldvorming werd uitgevoerd tussen 15 minuten tot 1 uur na plating voordat de cellen begonnen te migreren. Beelden werden elke 5 s gedurende 10 minuten verkregen, wat 121 beelden per cel opleverde (Aanvullende Film 1).
Beeldanalyse werd uitgevoerd met Behulp van ImageJ. Met het gereedschap Recht in de hoofdwerkbalk werden 20 willekeurige eenheidslange rechte lijnen gemaakt op een radiaal raster op dezelfde plaatsen om de 45 graden in alle cellen (figuur 2A). Om een kymograaf te genereren, gebruikten we de Image > Stack > Reslice-commando's, die een kymograafafbeelding opleverden die de beweging van afzonderlijke punten binnen het celmembraan beschrijft (figuur 2B-D). Het aantal uitsteeksels, retracties en ruches gevormd gedurende 10 minuten van de film in elk van de acht regio's in de cellen, die worden gemarkeerd door de rasterlijnen, werd geëxtraheerd, handmatig geteld uit de respectieve kymograafafbeeldingen en uitgezet in een grafiek als uitsteeksels / retracties / ruches frequenties per 10 minuten. De gemiddelde verkregen frequenties waren 5,1/10 min voor uitsteeksels en retracties en 2,1/10 min voor ruches (figuur 2E).
De uitsteekselafstand, uitsteekseltijd, retractietijd, uitsteeksel- en retractiesnelheden werden berekend uit de gegenereerde kymografen. In de representatieve kymograaf in figuur 3 was de uitsteekselafstand 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, de uitsteekseltijd was 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min, de retractietijd was 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min. Uitsteeksel- en retractiesnelheden werden berekend als 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min.
Bij het meten van het uitsteeksel van de celrand is het belangrijk om cellen te kiezen die zich in hun verspreidingsfase bevinden. Een voorbeeld van een juiste cel voor analyse wordt weergegeven in figuur 2A en aanvullende film 1. Na kymografie-analyse kunnen de uitsteeksels, retracties en ruches gemakkelijk worden onderscheiden in dit experiment. Een voorbeeld van een wild-type fibroblast dat niet geschikt is voor analyse is weergegeven in figuur 4. Na kymografie-analyse kunnen bijvoorbeeld in lijnen (plakjes) 1, 3, 5, 7 duidelijke uitsteeksels worden onderscheiden. In dit geval is de cel klaar met verspreiden, maar is nog niet begonnen met bewegen, en daarom kunnen er niet veel membraanbewegingen worden waargenomen.
Figuur 1: Experimentele stadia van de uitsteekseltest. (A) Een 1N HCl-oplossing wordt gedurende 20 minuten aan de schotel met glazen bodem toegevoegd. (B) Na het wassen in PBS wordt 10 μg/ml fibronectine-oplossing toegevoegd aan het glazen deel van de schaal en gedurende 1 uur geïncubeerd bij 37 °C. (C) De glazen bodem van de schotel wordt geblokkeerd door incubatie in 1% gedenatureerd BSA gedurende 1 uur bij 37 °C. (D) Een weefselkweekplaat van 70%-80% geconfluente fibroblasten wordt trypsine-trypsine en geteld (E) 20.000 cellen worden in een schaal met glazen bodem verguld en (F) gedurende 15 minuten bij 37 °C geïncubeerd om cellen in staat te stellen zich te verspreiden. (G) De plaat wordt geplaatst in een microscoop vochtige kamer met 37 °C in 5% CO2, en live beeldvorming wordt uitgevoerd door fase-contrast licht microscopie. (H) Celfilms en afbeeldingen worden onderworpen aan kymografie-analyse door Afbeelding J. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Beeldanalyse van de uitsteekseltest. (A) Representatief beeld van MEF in imageJ met aangegeven acht membraandoorsneden voor kwantificering gedurende 10 minuten. Schaalbalk, 20 μm. (B) Generatie van een kymograaf in afbeelding J. (C) Representatieve kymograaf uit doorsnede waarop uitsteeksels, retracties en ruches kunnen worden onderscheiden. (D) Resulterende kymografen na beeldanalyse gedurende 10 minuten in Afbeelding J met behulp van de opdracht Reslice . (E) Kwantificering van uitsteeksels, retracties en ruches frequenties per 10 minuten van de geanalyseerde film en kymograaf. Gemiddelde uitsteekfrequentie per 10 min = 5,1, gemiddelde retractiefrequentie per 10 min = 5,125, gemiddelde ruchesfrequentie per 10 min = 2,1. Acht kymografen werden geanalyseerd uit één film. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse en kwantificering van uitsteekselperistentie, afstand en snelheid. In de representatieve kymograaf vertegenwoordigt de X-as de tijd in min (van links naar rechts) en de Y-as toont de afstand in μm. X1 staat voor uitsteekseltijd (persistentie), X2 voor retractietijd en Y voor de uitsteekselafstand. Uitsteekselsnelheid wordt berekend door de uitsteekselafstand (Y) te delen door de uitsteekseltijd (X1). De retractiesnelheid wordt berekend door de uitsteekselafstand (Y) te delen door de retractietijd (X2). In dit voorbeeld was de uitsteekselafstand 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm, de uitsteekseltijd was 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min., de retractietijd was 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min. De uitsteeksel-/retractiesnelheid werd berekend als 4,875 μm/0,6664 min. = 7,315 μm/min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeld van een cel die moet worden uitgesloten van de analyse. (A) Een voorbeeld van een cel die niet geschikt is voor analyse. Schaalbalk, 20 μm. (B) De kymografie-analyse van deze cel laat, vooral bij re-slice 1,3,5,7, geen duidelijke uitsteeksels zien. In dit geval is de cel klaar met verspreiden, maar begon nog niet te bewegen, en daarom kunnen er niet veel membraanuitsteeksels worden waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende film 1. MEF werd verguld op een met fibronectine gecoate schotel met glazen bodem en afgebeeld met behulp van time-lapse fasecontrastvideomicroscopie gedurende 10 minuten met behulp van 40x / 1.4 NA droog objectief. De tijd wordt aangegeven in seconden. Schaalbalk, 10 μm. Klik hier om deze film te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cel-edge uitsteekseldynamiek, bestaande uit uitsteeksels, retracties en ruches, is zowel een vereiste als een potentiële snelheidsbeperkende gebeurtenis in celmotiliteit. Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode voor het meten van de dynamiek van celranduitsteeksels tijdens het verspreiden. Deze methode maakt beeldvorming met een korte tijd mogelijk, genereert een aanzienlijke hoeveelheid gegevens, vereist geen fluorescerende etikettering van cellen of dure fluorescerende microscopieapparatuur en kan worden gebruikt als een voorlopige methode voor het testen van cytoskeletale dynamica die betrokken is bij celmotiliteit voordat wordt besloten om meer middelen-veeleisende methoden uit te voeren. Bovendien kan men knock-out- of knockdown-cellen en / of eiwitmutanten in deze test gebruiken als een snel en eenvoudig hulpmiddel om kritieke eiwitten en potentiële signaleringsmechanismen te identificeren die betrokken zijn bij cytoskeletdynamiek.
Let op, het is belangrijk om de juiste cellen te kiezen voor uitsteekselanalyse. Cellen worden gedurende 15 minuten geïncubeerd voordat films worden verkregen om verspreiding mogelijk te maken. Als men besluit om uitsteeksel te meten tijdens het verspreiden (in tegenstelling tot het meten van uitsteeksels tijdens migratie), dan moeten alleen cellen die zich in hun verspreidingsfase bevinden tijdens filmacquisitie in beeld worden gebracht. Cellen die zich niet begonnen te verspreiden, zijn niet geschikt voor kymografie-analyse. Cellen die hun verspreidingsfase hebben voltooid maar niet zijn gaan bewegen (figuur 4), zijn ook niet geschikt voor analyse. De beweging van hun kern kan deze cellen onderscheiden: tijdens het verspreiden is de kern stationair, terwijl tijdens de celmigratie de kern dynamisch is en lokaliseert aan de achterkant van de cel om een voorste rand-centrosoom-kernas te construeren in de richting van migratie. Een ander veel voorkomend probleem in de latere stadia van beeldvorming is een situatie waarin cellen elkaar raken. Dergelijke films moeten worden uitgesloten van analyse, omdat interacties en signalen van naburige cellen de uitsteekseldynamiek van de celrand kunnen verstoren.
In dit manuscript beschrijven we de analyse van celrand uitsteekseldynamiek met behulp van fasecontrast lichtmicroscopie. Deze methode kan worden uitgebreid om de dynamiek van intracellulaire componenten ook met fluorescentiemicroscopie te meten. Een dergelijk algemeen gebruik van fluorescerende kymografie wordt vaak beschreven voor het meten van de dynamiek van cytoskeletstructuren in cellen. Dogget en Breslin hebben bijvoorbeeld kymografie van GFP-actine getransfecteerde HUVEC-cellen gebruikt om de dynamiek en omzet van actinestressvezels te analyseren14.
Dit protocol en verschillende andere eerdere artikelen gebruikten fibroblasten verguld op fibronectine voor de celrand uitsteekseltest en voor tweedimensionale celmotiliteitstests. Fibroblasten worden vaak gebruikt voor motiliteitstests en andere gerelateerde testen zoals de celranduitsteekdynamiektest omdat ze mesenchymaal en beweeglijk zijn en duidelijke cytoskeletale structuren hebben zoals lamellipodia, filopodia en focale verklevingen. Hoewel we de test voor andere celtypen en substraten niet beschrijven, kan deze methode gemakkelijk worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, in de eerste documentatie van de lamellendynamica-test, die wij en anderen hebben gewijzigd om de celrand uitsteekseldynamiektest11 te worden, gebruikten de auteurs keratinocyten die door EGF werden gestimuleerd om te migreren in een krastest, wat aantoont dat andere celtypen en andere stimulaties op deze test kunnen worden toegepast. Bovendien, hoewel we de meting van celrand uitsteekseldynamiek beschrijven tijdens celspreiding, zou dezelfde methode kunnen worden gebruikt door de dynamiek van uitsteeksels tijdens migratie van cellen te meten, zoals bijvoorbeeld aangetoond in Bear et al.12 en Hinz et al.11.
Inderdaad, verschillende laboratoria hebben deze test op MEF's gebruikt om cytoskeletale dynamica en signaleringsmechanismen in het verleden op te helderen. Miller et al. hadden bijvoorbeeld eerder de uitsteekseltest gebruikt om aan te tonen dat Abl2/Arg het contact tussen actine en microtubuli aan de celrand bemiddelt15. Bryce et al. toonden met behulp van de test aan dat cortactine knockdown-cellen een verminderde celmotiliteit hebben die samenvalt met een verslechtering van de persistentie van lamellipodiale uitsteeksels. Dit defect is het gevolg van aantasting van de assemblage van nieuwe verklevingen in uitsteeksels16. Lapetina et al. gebruikten de celrand uitsteekseltest in Abl2/Arg knockout en cortactin knockdown cellen gered met mutanten van de twee eiwitten om een Abl2/Arg-gemedieerd regulatiemechanisme cel-edge uitsteeksels op te helderen17. Met behulp van dezelfde test hebben Miller et al. ook aangetoond dat Arg N-WASP-gemedieerde actinepolymerisatie en de daaruit voortvloeiende celranduitsteekseldynamiek reguleert18. We hebben onlangs de celranduitsteekseltest gebruikt om aan te tonen dat het niet-receptor tyrosinekinase Pyk2 de dynamiek van uitsteeksels en daaropvolgende celmigratie reguleert via directe en indirecte interacties met het adaptoreiwit CrkII. In dit artikel hebben we Pyk2-WT en Pyk2-/- en Crk-WT en knockdown MEF, reddingsmutanten en epistase-experimenten gebruikt om de moleculaire interacties en signaleringshiërarchie tussen de twee eiwitten tijdens het uitsteeksel van de celrand op te helderen. Dit nieuwe complexe regulatiemechanisme maakt het mogelijk om de uitsteekseldynamiek van de celrand en de daaruit voortvloeiende celmigratie te verfijnen, samen met een strakke regeling van de celmotiliteit aan de andere kant19. Met behulp van de celrand uitsteekseltest hebben de bovenstaande artikelen en andere die volgden onze kennis van de regulatiemechanismen van celranduitsteeksels in het bijzonder en celmigratie in het algemeen aanzienlijk vergroot.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies NIH MH115939, NS112121, NS105640 en R56MH122449-01A1 (aan Anthony J. Koleske) en van de Israel Science Foundation (subsidies nummer 1462/17 en 2142/21) (aan Hava Gil-Henn).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
References
- Kurosaka, S., Kashina, A.
- Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112 (4), 453-465 (2003).
- Ponti, A., Machacek, M., Gupton, S. L., Waterman-Storer, C. M., Danuser, G. Two distinct actin networks drive the protrusion of migrating cells. Science. 305 (5691), 1782-1786 (2004).
- Chesarone, M. A., DuPage, A. G., Goode, B. L. Unleashing formins to remodel the actin and microtubule cytoskeletons. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (1), 62-74 (2010).
- Chesarone, M. A., Goode, B. L. Actin nucleation and elongation factors: mechanisms and interplay. Current Opinion in Cell Biology. 21 (1), 28-37 (2009).
- Lee, J. M. The Actin Cytoskeleton and the Regulation of Cell Migration. Colloquium series on building blocks of the cell: cell structure and function. , Morgan and Claypool Life Sciences, Morgan and Claypool Publishers. (2013).
- Giannone, G., et al. Lamellipodial actin mechanically links myosin activity with adhesion-site formation. Cell. 128 (3), 561-575 (2007).
- Tojkander, S., Gateva, G., Lappalainen, P. Actin stress fibers--assembly, dynamics and biological roles. Journal of Cell Science. 125, Pt 8 1855-1864 (2012).
- Wilson, C. A., et al. Myosin II contributes to cell-scale actin network treadmilling through network disassembly. Nature. 465 (7296), 373-377 (2010).
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nature Cell Biology. 9 (10), 1110-1121 (2007).
- Hinz, B., Alt, W., Johnen, C., Herzog, V., Kaiser, H. W. Quantifying lamella dynamics of cultured cells by SACED, a new computer-assisted motion analysis. Experimental Cell Research. 251 (1), 234-243 (1999).
- Bear, J. E., et al. Antagonism between Ena/VASP proteins and actin filament capping regulates fibroblast motility. Cell. 109 (4), 509-521 (2002).
- Jacks laboratory protocol. , Available from: http://jacks-lab.mit.edu/protocols/making_mefs (2021).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3187 (2011).
- Miller, A. L., Wang, Y., Mooseker, M. S., Koleske, A. J. The Abl-related gene (Arg) requires its F-actin-microtubule cross-linking activity to regulate lamellipodial dynamics during fibroblast adhesion. Journal of Cell Biology. 165 (3), 407-419 (2004).
- Bryce, N. S., et al. Cortactin promotes cell motility by enhancing lamellipodial persistence. Current Biology. 15 (14), 1276-1285 (2005).
- Lapetina, S., Mader, C. C., Machida, K., Mayer, B. J., Koleske, A. J. Arg interacts with cortactin to promote adhesion-dependent cell edge protrusion. Journal of Cell Biology. 185 (3), 503-519 (2009).
- Miller, M. M., et al. Regulation of actin polymerization and adhesion-dependent cell edge protrusion by the Abl-related gene (Arg) tyrosine kinase and N-WASp. Biochemistry. 49 (10), 2227-2234 (2010).
- Lukic, N., et al. Pyk2 regulates cell-edge protrusion dynamics by interacting with Crk. Molecular Biology of the Cell. , (2021).
