Medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas
Summary
Este protocolo visa medir os parâmetros dinâmicos (saliências, retrações, babados) de saliências na borda das células disseminar.
Abstract
O desenvolvimento e a homeostase dos organismos multicelulares dependem da regulação coordenada da migração celular. A migração celular é um evento essencial na construção e regeneração de tecidos, e é fundamental no desenvolvimento embrionário, respostas imunológicas e cicatrização de feridas. A desregulação da motilidade celular contribui para distúrbios patológicos, como inflamação crônica e metástase do câncer. Migração celular, invasão de tecido, axônio e dendrito superam tudo iniciado com saliências mediadas por células mediadas por actina. Aqui, descrevemos um método simples, eficiente e de economia de tempo para a imagem e análise quantitativa da dinâmica de saliência de borda celular durante a disseminação. Este método mede características discretas da dinâmica da membrana de borda celular, como saliências, retrações e babados, e pode ser usado para avaliar como as manipulações de principais reguladores de actina impactam as saliências de borda celular em diversos contextos.
Introduction
A migração celular é um processo crítico que controla o desenvolvimento e a função de todos os organismos vivos. A migração celular ocorre em ambas as condições fisiológicas, como embriogênese, cicatrização de feridas e resposta imune, e em condições patológicas, como metástase do câncer e doença autoimune. Apesar das diferenças nos tipos celulares que participam de diferentes eventos migratórios, todos os eventos de motilidade celular compartilham mecanismos moleculares semelhantes, que foram conservados na evolução do protozoário aos mamíferos, e envolvem mecanismos comuns de controle citoesquelético que podem sentir o ambiente, responder a sinais e modular o comportamento celular em resposta1.
Um estágio inicial na migração celular pode ser a formação de saliências altamente dinâmicas na borda principal da célula. Por trás do lamellipodium pode-se encontrar a lamella, que casais atuam na contratelidade mediada por Myosin II e media a adesão ao substrato subjacente. Lamellipodia são induzidas por estímulos extracelulares, como fatores de crescimento, citocinas e receptores de adesão celular e são impulsionadas pela polimerização de actina, que fornece a força física que empurra a membrana plasmática para frente2,3. Muitas sinalizações e proteínas estruturais foram implicadas nisso; entre eles estão rho GTPases, que atuam coordenadamente com outros sinais para ativar proteínas reguladoras de actina, como o complexo Arp 2/3, proteínas familiares WASP e membros das famílias Formin e Spire em lamellipodia2,4,5.
Além da polimerização de actina, a atividade de miose II é necessária para a geração de forças contratuais no lamellipodium e na lamella anterior. Essas contrações, também definidas como retrações de borda celular, também podem resultar da despolimerização da actina dendrítica na periferia celular e são fundamentais para o desenvolvimento da borda principal lamellipodial e permitindo que a protrusão sinta a flexibilidade da matriz extracelular e outras células e determine a direção da migração6,7,8 . As saliências de borda celular que não podem ser anexadas ao substrato formarão babados de membrana periférica, estruturas semelhantes a folhas que aparecem na superfície ventral de lamellipodia e lamella e se movem para trás em relação à direção da migração. Como o lamellipodium não se prende ao substrato, um lamellipodium posterior se forma por baixo dele e empurra mecanicamente o primeiro lamellipodium em direção à superfície ventral superior. Os filamentos de actin no babado que antes eram paralelos ao substrato agora se tornam perpendiculares a ele, e o babado está agora posicionado acima do lamellipodium avançando. O babado que se move para trás cai de volta no citosol e representa um mecanismo celular para reciclagem de atolopodial em 9,10.
Aqui, descrevemos um ensaio para a medição da dinâmica de saliência de borda celular. O ensaio de saliência usa microscopia de vídeo de lapso de tempo para medir a dinâmica de saliência de borda única por 10 minutos durante a fase de disseminação da célula. A dinâmica da saliência é analisada gerando kymogramas a partir desses filmes. Em princípio, um kymograph transmite dados quantitativos detalhados de partículas móveis em uma trama esposteterna para produzir uma compreensão qualitativa da dinâmica das bordas celulares. A intensidade da partícula móvel é traçada para todas as pilhas de imagens em uma trama tempo versus espaço, onde o eixo X e o eixo Y representam tempo e distância, respectivamente11. Este método usa uma análise manual de kymógrafo com ImageJ para obter dados quantitativos detalhados, permitindo a recuperação de informações de filmes e imagens em caso de baixa relação sinal-ruído e/ou alta densidade de recursos, e a análise de imagens adquiridas em microscopia de luz de contraste de fase ou má qualidade da imagem.
O ensaio de saliência de borda celular descrito aqui é um método rápido, simples e econômico. Como tal, e porque tem sido mostrado correlacionar diretamente com a migração celular11,12, pode ser usado como um método preliminar para testar dinâmicas citoesqueletal envolvidas na motilidade celular antes de decidir realizar métodos mais exigentes de recursos. Além disso, também permite a medição quantitativa de como as manipulações genéticas (knockout, knockdown ou construtos de resgate) de proteínas citoesqueletal impactam a dinâmica citoesqueletal usando uma plataforma simples. O ensaio é um modelo instrutivo para explorar a dinâmica citoesquelético no contexto da migração celular e poderia ser usado para elucidação dos mecanismos e moléculas subjacentes à motilidade celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
A dinâmica de saliência de borda celular, composta por saliências, retrações e babados, é um pré-requisito e um evento potencial limitante de taxas na motilidade celular. Aqui descrevemos um método rápido e simples para medir a dinâmica das saliências de borda celular durante a disseminação. Este método permite imagens de curto prazo, gera uma quantidade significativa de dados, não requer rotulagem fluorescente de células ou equipamentos de microscopia fluorescente caros, e poderia ser usado como um méto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH MH115939, NS112121, NS105640 e R56MH122449-01A1 (a Anthony J. Koleske) e pela Fundação Israel Science (bolsas nº 1462/17 e 2142/21) (para Hava Gil-Henn).
Materials
| 10 cm cell culture plates | Greiner | P7612-360EA | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Biological Industries, Israel | 01-055-1A | Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose) |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS) | Biological Industries, Israel | 02-023-1A | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Biological Industries, Israel | 04-001-1A | |
| Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Glass bottom dishes | Cellvis | D35-20-1.5-N | 35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm). |
| ImageJ software | NIH | Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| LAS-AF Leica Application Suite 3.2 | Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS | ||
| Leica AF6000 | Leica | Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera . | |
| L-glutamine solution | Biological Industries, Israel | 03-020-1B | |
| ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera | Hamamatsu Photonics | ||
| Penicillin-streptomycin solution | Biological Industries, Israel | 03-031-1B | |
| Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%) | Biological Industries, Israel | 03-052-1A |
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