Habilidades Microcirúrgicas de Estabelecer Cannulação permanente de veia jugular em ratos para amostragem de sangue serial de droga administrada oralmente

Summary

Técnicas microcirúrgicas detalhadas são demonstradas para estabelecer um modelo de rato de cannulação vesícula ve jugular de longo prazo para coleta de sangue sequencial no mesmo animal. Parâmetros fisiológicos e hematológicos foram monitorados durante a fase de recuperação do rato. Este modelo foi aplicado para estudar farmacocinética de polifenól administrado oralmente sem induzir o estresse animal.

Abstract

A amostragem de sangue em pequenos animais de laboratório é necessária para a otimização do chumbo farmacêutico, mas pode causar grandes danos e estresse aos animais experimentais, o que pode afetar os resultados. A cannulação venosa jugular (JVC) em ratos é um modelo amplamente utilizado para coleta repetida de sangue, mas requer treinamento adequado de habilidades cirúrgicas e cuidados com animais. Este artigo detalha os procedimentos microcirúrgicos para estabelecer e manter um modelo permanente de ratos JVC com foco específico na colocação e vedação da cânula jugular. A importância do monitoramento fisiológico (por exemplo, peso corporal, alimentação e ingestão de água) e parâmetros hematológicos, foi destacada com resultados apresentados durante 6 dias após a cirurgia durante a recuperação do rato. O perfil de tempo de concentração de plasma de drogas administradas oralmente ácido ellagico foi determinado no modelo de rato JVC.

Introduction

A repetida aquisição de amostras de sangue de pequenos animais de laboratório, como roedores, cobaias e coelhos, é um aspecto importante para a otimização do chumbo farmacêutico e também para a redução do número de animais utilizados na pesquisa ^1,2. O pipeline para o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico e formulação de medicamentos (por exemplo, vacina) requer acesso a diferentes volumes de sangue, a fim de avaliar sua robustez e desempenho in vivo, como farmacocinética (PK), toxicidade e sensibilidade ^3,4,5.

A abordagem laboratorial para coleta de amostras de sangue é amplamente classificada em dois tipos, cirúrgico e não cirúrgico⁶. A abordagem não cirúrgica é relativamente fácil de entender para o pesquisador, o que inclui técnicas comuns, como punção cardíaca, punção sinusal orbital e sangramento da veia safena e da cauda. A amostragem múltipla de sangue é possível por alguns métodos não cirúrgicos, mas o volume amostral é pequeno e pode causar ferimentos físicos e estresse psicológico aos animais¹. Por outro lado, a abordagem cirúrgica é uma alternativa favorita à venipuntura repetida, e envolve a colocação de uma cânula temporária ou permanente nos vasos sanguíneos dos animais ^7,8,9. O grande volume sanguíneo poderia ser repetidamente retirado através da cânula em ratos conscientes, evitando o estresse e a dor devido à técnica de manuseio, contenção e anestesia 7,8,10,11. No entanto, a implantação da cânula requer um pesquisador experiente com treinamento adequado para coletar o sangue com sucesso.

A coleta de sangue através da cannulação venosa jugular (JVC) em ratos é o método mais utilizado para estudar a droga PK 6,10,12,13. No entanto, o estabelecimento do modelo jvc de ratos precisa de uma prática cuidadosa de habilidades microcirúrgicas e conhecimento de cuidados pós-cirúrgicos e manutenção. Especialmente, após a cirurgia, o rato requer administração de analgésicos e tempo de recuperação suficiente para atingir condição fisiológica estável para novos experimentos 13,14,15. Embora o ganho de peso corporal (ou seja, >10 g) seja um indicador válido e comumente aplicado para a recuperação do rato, não é incomum que os ratos tenham morte inesperada no pós-operatório devido à desidratação, infecção e inflamação, o que pode ser sutil de notar no início precoce^14,15. Além disso, a obstrução do cateter no modelo JVC continua a ser um problema durante a coleta de sangue.

O presente protocolo demonstrou em detalhes os procedimentos microcirúrgicos para JVC em um rato anestesiado com foco específico na identificação, isolamento e cannulação da veia jugular. Destaca-se a importância do monitoramento fisiológico e hematológico dos ratos durante a fase de recuperação. Finalmente, amostras de sangue em série foram coletadas através do cateter venoso para estudar o PK do ácido ellagico natural administrado oralmente com baixa biodisponibilidade (ou seja, baixa concentração sistêmica) para verificar o modelo de rato JVC.

Protocol

Os procedimentos descritos abaixo foram realizados como parte de um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Politécnica do Noroeste (No. 202101117). 1. Preparação pré-operatória (um dia antes da cirurgia) NOTA: Soluções necessárias: soro fisiológico normal (cloreto de sódio 0,9% w/v), soro fisiológico heparinizado (1% c/v heparina de sódio), solução de bloqueio de cateter, anti-inflamat?…

Representative Results

Este protocolo demonstrou minuciosamente como estabelecer um modelo JVC de longo prazo usando habilidades microcirúrgicas para coleta de sangue serial. A Figura 1A mostra os instrumentos cirúrgicos essenciais e materiais utilizados para a realização da cirurgia. A especificação do cateter PU com três marcas azuis também é ilustrada, o que é útil para orientar o pesquisador a colocar a cânula venosa na etapa 3.3., como usar as marcas no cateter pu para guiar a cannulaçã…

Discussion

Dominar a técnica de cannulação de vasos requer prática significativa e aprender a lição de cada operação. Christakis et al. usando a análise da soma cumulativa (CUSUM), descobriram que um pesquisador precisa praticar 200 ratos durante um período de um ano antes de estar pronto para a avaliação pk de candidatos a medicamentos²⁰. No entanto, o tempo de operação necessário para a cannulação venosa pode ser significativamente reduzido pelo número de ratos realizados<sup class="xref"…

Materials

0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant	Xinkang	N/A	collecting blood samples for hematology test
0.5*20 mm 1.0-mL syringe	KLMEDICAL	N/A	washing or replacing the fluid with saline
0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe	HD	N/A	Subcutaneous injection
1.0-mL Blunt tipped syringe (22G)	skillsmodel	S4-PKT22G	Inject the saline and collect blood samples through catheter
1.5 mL sterile microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S	Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution
1.5 mL microcentrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M	blood collection
1/2  circle cutting 5*12 mm suture needle	skillsmodel	S4-FHZ	Thread the muscle layer to fix the catheter
3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle	skillsmodel	S5-FHZ	Suture the incision of rat cortex
6-0 sterile non-absorbable silk suture thread	JUNSHENG	N/A	ligature
75% medical alcohol	HONGSONG	N/A	Disinfection
Adhensive tape	LIUTAI	N/A	positioning the rat
Autoclave sterilization tape	Biosharp	BS-QT-028	Mark sterilized items
Automated blood cell counter	Sysmex	XN-550	Hematology test
Castroviejo micro scissors	skillsmodel	WA1010	Cut the opening in the blood vessel
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Plasma preparation
Clean cushion	Qingjie	N/A	Prepare the operation area
Cotton balls	HC	N/A	Wound disinfection and sterilization
Cotton swabs	BEITAGOGO	N/A	Disinfection
Curved hemostat	skillsmodel	N/A	ligature
DN50 Stainless-steel rat restrainer	skillsmodel	S4-RGDQ1	Restrict the movement of rats for easy operation
Ellagic acid	Aladdin	E102710-25g	natural phenol for oral administration
Half-curved forceps	skillsmodel	53072	Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture
Heating pad	Warm mate	N/A	preventing heat loss of animal
Heparin sodium	Solarbio	H8060	anticoagulant
Iodophor	Xidebao	N/A	Clean the wound
Iris scissors	skillsmodel	54002	Bluent separation the muscle layer
Isoflurane	RWD	R510-22-16	anaesthesia
LED lamp	EMPERORFEEL	N/A	sugery
Liquid chromatography-mass spectroscopy	Thermo Fisher Scientific	VQF01-20001/ TSQ02-10002	detection of drug concentration in plasma
Meloxicam	Hongqiang	N/A	Analgesic
Normal saline	KL	N/A	Prepara the solution and protect blood vessels from drying out
Pet razor	Codos	3180	Shaving the fur
Phosphate-buffered saline	ZHHC	PW012	Preparation of Ellagic acid solution
PU catheter	skillsmodel	RJVC-PU	Jugular vein cannulation
Small animal operation anesthesia console	RWD	68620	Operation workstation
Spray bottle	Other	N/A	aseptic workstation
Stainless steel plug (22G)	skillsmodel	S4-PKD22G	Plug the catheter to ensure its sealing
Stainless steel trochar	skillsmodel	S$-PKDGZ	Guide the catheter exteriorization
Sterile lock solution	skillsmodel	SK-FB	lock the catheter to ensure its sterility
Straight feeding needle	skillsmodel	N/A	Oral gavage
Surgical pouch	BKMAM	N/A	container for sterilization of surgical instruments
Surgical scissors	skillsmodel	J21070	Cut incision on rat skin
Vessel dilator balanced forceps	skillsmodel	WA3020	Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in
ZS-MV Small animal anesthesia machine	ZSLab	1057003	inducing and maintaining anaesthesia