Habilidades microquirúrgicas para establecer la canulación permanente de la vena yugular en ratas para el muestreo de sangre en serie del medicamento administrado por vía oral

Summary

Se han demostrado técnicas microquirúrgicas detalladas para establecer un modelo de rata de canulación de vena yugular a largo plazo para la recolección secuencial de sangre en el mismo animal. Los parámetros fisiológicos y hematológicos han sido monitoreados durante la fase de recuperación de la rata. Este modelo se ha aplicado para estudiar la farmacocinética del polifenol administrado por vía oral sin inducir estrés animal.

Abstract

El muestreo de sangre en pequeños animales de laboratorio es necesario para la optimización del plomo farmacéutico, pero puede causar un gran daño y estrés a los animales de experimentación, lo que podría afectar los resultados. La canulación de la vena yugular (JVC) en ratas es un modelo ampliamente utilizado para la recolección repetida de sangre, pero requiere un entrenamiento adecuado de las habilidades quirúrgicas y el cuidado de los animales. Este artículo detalla los procedimientos microquirúrgicos para establecer y mantener un modelo permanente de rata JVC con un enfoque específico en la colocación y sellado de la cánula yugular. Se destacó la importancia de monitorear los parámetros fisiológicos (por ejemplo, peso corporal, ingesta de alimentos y agua) y hematológicos, con resultados presentados durante 6 días después de la cirugía durante la recuperación de la rata. El perfil fármaco-concentración plasmática-tiempo del ácido elágico fenol natural administrado por vía oral se determinó en el modelo de rata JVC.

Introduction

La adquisición repetida de muestras de sangre de pequeños animales de laboratorio, como roedores, cobayas y conejos, es un aspecto importante para la optimización del plomo farmacéutico y también para reducir el número de animales utilizados en la investigación ^1,2. La cartera para desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico y formulación de medicamentos (por ejemplo, vacunas) requiere acceso a diferentes volúmenes de sangre para evaluar su robustez y rendimiento in vivo, como la farmacocinética (PK), la toxicidad y la sensibilidad ^3,4,5.

El enfoque de laboratorio para la recolección de muestras de sangre se clasifica ampliamente en dos tipos, quirúrgico y no quirúrgico⁶. El enfoque no quirúrgico es relativamente fácil de comprender para el investigador, que incluye técnicas comunes, como la punción cardíaca, la punción del seno orbitario y el sangrado de la vena safena y de la cola. El muestreo múltiple de sangre es posible mediante algunos métodos no quirúrgicos, pero el volumen de la muestra es pequeño y puede causar heridas físicas y estrés psicológico a los animales¹. Por otro lado, el abordaje quirúrgico es una alternativa favorita a la venopunción repetida, e implica la colocación de una cánula temporal o permanente en los vasos sanguíneos de los animales ^7,8,9. El gran volumen de sangre podría extraerse repetidamente a través de la cánula en ratas conscientes, evitando el estrés y el dolor debido a la técnica de manipulación, la restricción y la anestesia 7,8,10,11. Sin embargo, la implantación de la cánula requiere un investigador experimentado con la capacitación adecuada para recolectar con éxito la sangre.

La recolección de sangre a través de la canulación de la vena yugular (JVC) en ratas es el método más utilizado para estudiar el fármaco PK ^6,10,12,13. Sin embargo, el establecimiento del modelo de rata JVC necesita una práctica cuidadosa de las habilidades microquirúrgicas y el conocimiento de la atención y el mantenimiento postquirúrgicos. Especialmente, después de la cirugía, la rata requiere la administración de analgésicos y el tiempo de recuperación suficiente para alcanzar una condición fisiológica estable para experimentos posteriores 13,14,15. Aunque el aumento de peso corporal (es decir, >10 g) es un indicador válido y comúnmente aplicado para la recuperación de la rata, no es raro que las ratas tengan una muerte inesperada después de la operación debido a deshidratación, infección e inflamación, que podría ser sutil notar al inicio temprano^14,15. Además, la obstrucción del catéter en el modelo JVC sigue siendo un problema durante la extracción de sangre.

El presente protocolo ha demostrado en detalle los procedimientos microquirúrgicos para JVC en una rata anestesiada con un enfoque específico en la identificación, aislamiento y canulación de la vena yugular. Se destaca la importancia del seguimiento fisiológico y hematológico de las ratas durante la fase de recuperación. Finalmente, se recogieron muestras de sangre seriadas a través del catéter venoso para estudiar el PK del ácido elágico fenol natural administrado por vía oral con mala biodisponibilidad (es decir, baja concentración sistémica) para verificar el modelo de rata JVC.

Protocol

Los procedimientos que se describen a continuación se realizaron como parte de un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Politécnica del Noroeste (No. 202101117). 1. Preparación preoperatoria (el día antes de la cirugía) NOTA: Soluciones requeridas: solución salina normal (cloruro de sodio al 0,9% p/v), solución salina heparinizada (1% p/v heparina sódica), solución de bloqueo del catét…

Representative Results

Este protocolo ha demostrado a fondo cómo establecer un modelo JVC a largo plazo utilizando habilidades microquirúrgicas para la recolección de sangre en serie. La Figura 1A muestra los instrumentos y materiales quirúrgicos esenciales utilizados para llevar a cabo la cirugía. También se ilustra la especificación del catéter de PU con tres marcas azules, lo que es útil para guiar al investigador a colocar la cánula venosa en el paso 3.3., cómo usar las marcas en el catéte…

Discussion

Dominar la técnica de canulación de vasos requiere una práctica significativa y aprender la lección de cada operación. Christakis et al. utilizando el análisis de suma acumulativa (CUSUM), encontraron que un investigador necesita practicar 200 ratas durante un período de un año antes de estar listo para la evaluación pk de los candidatos a fármacos²⁰. Sin embargo, el tiempo de operación requerido para la canulación de la vena puede reducirse significativamente por el número de ratas r…

Materials

0.5 mL test tube containing EDTA anticoagulant	Xinkang	N/A	collecting blood samples for hematology test
0.5*20 mm 1.0-mL syringe	KLMEDICAL	N/A	washing or replacing the fluid with saline
0.6*28.5 mm 5.0-mL syringe	HD	N/A	Subcutaneous injection
1.0-mL Blunt tipped syringe (22G)	skillsmodel	S4-PKT22G	Inject the saline and collect blood samples through catheter
1.5 mL sterile microcentrifuge tube	Axygen	MCT-150-C-S	Store sterile catheter lock solution heparinized saline and meloxicam solution
1.5 mL microcentrifuge tubes	Biosharp	BS-15-M	blood collection
1/2  circle cutting 5*12 mm suture needle	skillsmodel	S4-FHZ	Thread the muscle layer to fix the catheter
3/8 circle cutting 7*17 mm suture needle	skillsmodel	S5-FHZ	Suture the incision of rat cortex
6-0 sterile non-absorbable silk suture thread	JUNSHENG	N/A	ligature
75% medical alcohol	HONGSONG	N/A	Disinfection
Adhensive tape	LIUTAI	N/A	positioning the rat
Autoclave sterilization tape	Biosharp	BS-QT-028	Mark sterilized items
Automated blood cell counter	Sysmex	XN-550	Hematology test
Castroviejo micro scissors	skillsmodel	WA1010	Cut the opening in the blood vessel
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002402	Plasma preparation
Clean cushion	Qingjie	N/A	Prepare the operation area
Cotton balls	HC	N/A	Wound disinfection and sterilization
Cotton swabs	BEITAGOGO	N/A	Disinfection
Curved hemostat	skillsmodel	N/A	ligature
DN50 Stainless-steel rat restrainer	skillsmodel	S4-RGDQ1	Restrict the movement of rats for easy operation
Ellagic acid	Aladdin	E102710-25g	natural phenol for oral administration
Half-curved forceps	skillsmodel	53072	Lift the muscle layer and tissue, isolate the jugular vein and tie the suture
Heating pad	Warm mate	N/A	preventing heat loss of animal
Heparin sodium	Solarbio	H8060	anticoagulant
Iodophor	Xidebao	N/A	Clean the wound
Iris scissors	skillsmodel	54002	Bluent separation the muscle layer
Isoflurane	RWD	R510-22-16	anaesthesia
LED lamp	EMPERORFEEL	N/A	sugery
Liquid chromatography-mass spectroscopy	Thermo Fisher Scientific	VQF01-20001/ TSQ02-10002	detection of drug concentration in plasma
Meloxicam	Hongqiang	N/A	Analgesic
Normal saline	KL	N/A	Prepara the solution and protect blood vessels from drying out
Pet razor	Codos	3180	Shaving the fur
Phosphate-buffered saline	ZHHC	PW012	Preparation of Ellagic acid solution
PU catheter	skillsmodel	RJVC-PU	Jugular vein cannulation
Small animal operation anesthesia console	RWD	68620	Operation workstation
Spray bottle	Other	N/A	aseptic workstation
Stainless steel plug (22G)	skillsmodel	S4-PKD22G	Plug the catheter to ensure its sealing
Stainless steel trochar	skillsmodel	S$-PKDGZ	Guide the catheter exteriorization
Sterile lock solution	skillsmodel	SK-FB	lock the catheter to ensure its sterility
Straight feeding needle	skillsmodel	N/A	Oral gavage
Surgical pouch	BKMAM	N/A	container for sterilization of surgical instruments
Surgical scissors	skillsmodel	J21070	Cut incision on rat skin
Vessel dilator balanced forceps	skillsmodel	WA3020	Expand the blood vessel and guide the cannula to slide in
ZS-MV Small animal anesthesia machine	ZSLab	1057003	inducing and maintaining anaesthesia