JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

חקירת חילוף החומרים הלבבי בלב עכבר מבודד עם היפרפולריזציה [1-13C] פירובט וספקטרוסקופיית NMR 13C/31P

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/63188
, , , , ,
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine,Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

אנו מתארים מערך ניסיוני לניהול מטבוליטים היפרפולריים 13בעלי תווית C במצב זילוח רציף ללב עכבר מבודד ומחורר. גישה ייעודית לרכישת 13C-NMR אפשרה לכמת את פעילות האנזים המטבולי בזמן אמת, וניתוח מולטי-פרמטרי של 31P-NMR איפשר לקבוע את תכולת ה-ATP וה-pH של הרקמה.

Abstract

חילוף החומרים הוא הבסיס לתהליכים חשובים בחיים התאיים. אפיון האופן שבו רשתות מטבוליות מתפקדות ברקמות חיות מספק מידע חיוני להבנת מנגנון המחלות ולתכנון טיפולים. בעבודה זו, אנו מתארים נהלים ומתודולוגיות לחקר פעילות מטבולית בתוך התא בלב עכבר מחורר בזמן אמת. הלב בודד באתרו, בשילוב עם דום לב כדי למזער את איסכמיה שריר הלב והיה מחורר בתוך ספקטרומטר תהודה מגנטית גרעינית (NMR). בעודו בספקטרומטר ותחת זילוח מתמשך, פירובט היפרפולרי [1-13 C] ניתן ללב, וקצבי הייצור ההיפרפולריים הבאים [1-13C] לקטט ו[13C] ביקרבונט שימשו לקביעה, בזמן אמת, את שיעורי ייצור לקטט דהידרוגנאז ופירובט דהידרוגנאז. פעילות מטבולית זו של פירובט היפרפולרי [1-13C] כומתה באמצעות ספקטרוסקופיית NMR במודל חופשי תוך שימוש בגישת רכישת עירור רווי סלקטיבי של המוצר. 31 ספקטרוסקופיית P יושמה בין הרכישות ההיפרפולריות כדי לעקוב אחר אנרגיית הלב וה- pH. מערכת זו שימושית באופן ייחודי לחקר פעילות מטבולית בלב עכבר בריא וחולה.

Introduction

שינויים במטבוליזם הלב קשורים למגוון של קרדיומיופתיות ולעתים קרובות מהווים את הבסיס למנגנונים הפתופיזיולוגיים הבסיסיים1. עם זאת, ישנם מכשולים רבים לחקר חילוף החומרים ברקמות חיות, שכן רוב הבדיקות הביוכימיות דורשות הומוגניזציה של הרקמה וליזה התא ו / או מעקב רדיואקטיבי. לכן, יש צורך דחוף בכלים חדשים לחקור את חילוף החומרים של שריר הלב ברקמות חיות. תהודה מגנטית (MR) של מצעים היפרפולריים 13בעלי תווית C מאפשרת מדידות בזמן אמת של חילוף החומרים ברקמות חיות2, ללא שימוש בקרינה מייננת, על ידי הגדלת יחס אות ה-MR לרעש (SNR) של האתר(ים) המסומנים במספר סדרי גודל3. כאן אנו מתארים מערך ניסויי, גישת רכישה וגישה אנליטית לחקר חילוף החומרים המהיר בלב העכבר המבודד, ובמקביל מציגים אינדיקטורים של אנרגיה וחומציות כללית של רקמות. ה- pH הלבבי הוא אינדיקטור חשוב, שכן איזון בסיס חומצה מופר בשלבים המוקדמים של מחלות לב ותנאים כגון איסכמיה שריר הלב, היפרטרופיה לא מסתגלת ואי ספיקת לב6.

ייצור היפרפולרי [1-13 C]לקטט ו-[13 C]ביקרבונט מהיפרפולריזציה [1-13C]פירובט מסייע בקביעת שיעורי הייצור של לקטט דהידרוגנאז (LDH) ופירובט דהידרוגנאז (PDH). רוב המחקרים הקודמים שבוצעו באמצעות סובסטרטים היפרפולריים בלב המכרסם המבודד השתמשו במודלים קינטיים מורכבים כדי לגזור את הפעילות האנזימטית של LDH ו- PDH, או דיווחו על יחסי עוצמת האות של המוצר ההיפרפולרי למצע מבלי לחשב את שיעורי פעילות האנזים בפועל 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. כאן, השתמשנו במוצר סלקטיבי רוויה-עירור גישה 15, המאפשרת ניטור של פעילות האנזים באופן ללא מודל15,16. בדרך זו נקבעו השיעורים האנזימטיים המוחלטים (כלומר, מספר השומות של המוצר המיוצר ליחידת זמן). 31 ספקטרוסקופיית P שימשה לצפייה באותות של פוספט אנאורגני (Pi), פוספוקריאטין (PCr) ואדנוזין טריפוספט (ATP). ניתוח רב-פרמטרי שימש לאפיון התפלגות ה- pH של הלב, כפי שהודגם על ידי השינוי הכימי ההטרוגני באות פאי של הרקמה.

לב העכבר המחורר לאחור (לב לנגנדורף) 17,18,19 הוא מודל אקס ויו ללב פועם שלם. במודל זה, כדאיות הלב וה- pH נשמרים לפחות 80 דקות20, והוא הראה פוטנציאל התאוששות לאחר פגיעה איסכמית ממושכת21,22. עם זאת, שונות לא מכוונת במהלך מיקרו-כירורגיה עלולה להוביל לשונות בכדאיות הרקמה בין הלבבות. מחקרים קודמים דיווחו על הידרדרות הלב הזה לאורך זמן19; לדוגמה, נצפתה ירידה בתפקוד ההתכווצות של 5%-10% לשעה18. האות אדנוזין טריפוספט (ATP) הוכח בעבר כמדווח על המצב האנרגטי של שריר הלב ועל הכדאיות23. כאן, ציינו כי הלב המחורר עשוי להראות מדי פעם שונות לא מכוונת ברמות הכדאיות, כפי שמודגם על ידי תוכן ATP, למרות העובדה שיש לנו זילוח רצוף ואספקת חמצן. אנו מראים כאן כי נרמול שיעורי LDH ו- PDH לתכולת ה- ATP של הלב מפחית את השונות בין הלב בשיעורים אלה.

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים את ההליך הכירורגי המשמש לקנולציה של הלב, בידוד וזילוח כתוצאה מכך בספקטרומטר NMR. יש לציין כי גישות כירורגיות אחרות שמטרתן לבודד ולבלבל את לב העכבר תוארו לפני24,25.

כמו כן מתוארות המתודולוגיות המשמשות לרכישת נתונים הקשורים לקצב אנזימטי בלב הפועם (באמצעות ספקטרוסקופיה של 13 C ופירובט היפרפולרי [1-13C]) ויכולת הקיום והחומציות של הלב (באמצעות ספקטרוסקופיית NMR של 31P). לבסוף, מוסברות המתודולוגיות האנליטיות לקביעת פעילויות אנזימים מטבוליים וכדאיות וחומציות רקמות.

Protocol

ועדת האתיקה המשותפת לאוניברסיטה העברית ולמרכז הרפואי הדסה אישרה את פרוטוקול המחקר לרווחת בעלי חיים (MD-19-15827-1). 1. הכנת חיץ קרבס-הנסלייט יום לפני הניסוי, הכינו גרסה שונה של חיץ קרבס-הנסלייט (KHB)26. בתחילה, יש להמיס 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 0.5 mM פירובט, 1.2 mM MgSO 4, 25 mM NaH…

Representative Results

ספקטרום 31P שתועד מלב עכבר מחורר עם KHB ומהמאגר לבדו מוצג באיור 1A. האותות של α-, β-, ו-γ-ATP, PCr ו-Pi נצפו בלב. אות ה-Pi היה מורכב משני מרכיבים עיקריים: בשדה הגבוה יותר (הצד השמאלי של האות), אות ה-Pi נבע בעיקר מה-KHB ב-pH של 7.4; בשדה התחתון (הצד הימני של האות), אות ה-Pi היה רחב יותר ופחות הומו…

Discussion

אנו מדגימים מערך ניסויי שנועד לחקור מטבוליזם היפרפולרי [1-13C] פירובט, אנרגטיקה של רקמות ו- pH במודל לב עכבר מבודד.

השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם כדלקמן: 1) להבטיח כי ה- pH של המאגר הוא 7.4; 2) לוודא שכל רכיבי המאגר כלולים; 3) הימנעות קרישת דם בכלי הלב על ידי זריקות הפרין; 4) הימנעות …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה קיבל מימון מהקרן הלאומית למדע במסגרת הסכם מענק מס’ 1379/18; מלגת ז’בוטינסקי של משרד המדע והטכנולוגיה למדעים יישומיים והנדסיים לדוקטורנטים ישירים מס’ 3-15892 לד”ש; ותוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מס’ 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff’s isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury – A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O’Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model – ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Tags

Hyperpolarized MRICardiac MetabolismIsolated Perfused Mouse HeartPyruvate Metabolism13C/31P NMR SpectroscopyKrebs-Henseleit BufferAerobic And Anaerobic MetabolismCardiac EnergeticsPHLactateInorganic PhosphatePerfusion SystemTemperature Control
check_url/63188?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image