Descrevemos uma configuração experimental para administrar metabólitos hiperpolarizados marcados com 13C no modo de perfusão contínua a um coração de rato perfundido isolado. Uma abordagem dedicada à aquisição de 13C-NMR permitiu a quantificação da atividade enzimática metabólica em tempo real, e uma análise multiparamétrica de 31P-NMR permitiu a determinação do conteúdo de ATP tecidual e do pH.
O metabolismo é a base de processos importantes na vida celular. Caracterizar como as redes metabólicas funcionam nos tecidos vivos fornece informações cruciais para a compreensão do mecanismo das doenças e a concepção de tratamentos. Neste trabalho, descrevemos procedimentos e metodologias para estudar a atividade metabólica intracelular em um coração de camundongo retrógrado perfundido em tempo real. O coração foi isolado in situ, em conjunto com parada cardíaca para minimizar a isquemia miocárdica e foi perfundido dentro de um espectrômetro de ressonância magnética nuclear (RMN). Enquanto no espectrômetro e sob perfusão contínua, o [1-13 C]piruvato hiperpolarizado foi administrado ao coração, e as subsequentes taxas de produção de [1-13 C]lactato e [13C]bicarbonato hiperpolarizadas serviram para determinar, em tempo real, as taxas de produção de lactato desidrogenase e piruvato desidrogenase. Esta atividade metabólica do [1-13C]piruvato hiperpolarizado foi quantificada com espectroscopia de RMN de forma livre usando a abordagem de aquisição de saturação seletiva de excitações do produto. 31 anos A espectroscopia de P foi aplicada entre as aquisições hiperpolarizadas para monitorar a energia cardíaca e o pH. Este sistema é excepcionalmente útil para estudar a atividade metabólica no coração de rato saudável e doente.
Alterações no metabolismo cardíaco estão associadas a uma variedade de cardiomiopatias e muitas vezes formam a base dos mecanismos fisiopatológicos subjacentes1. No entanto, existem inúmeros obstáculos para estudar o metabolismo em tecidos vivos, já que a maioria dos ensaios bioquímicos requer a homogeneização do tecido e lise celular e / ou rastreamento radioativo. Portanto, há uma necessidade premente de novas ferramentas para investigar o metabolismo miocárdico em tecidos vivos. A ressonância magnética (RM) de substratos hiperpolarizados marcados com 13C permite medições em tempo real do metabolismo em tecidos vivos2, sem o uso de radiação ionizante, aumentando a relação sinal-ruído (SNR) por RM do(s) sítio(s) marcado(s) em várias ordens de magnitude3. Aqui, descrevemos uma configuração experimental, uma abordagem de aquisição e uma abordagem analítica para estudar o metabolismo rápido no coração isolado de camundongos e, em paralelo, apresentar indicadores de energia e acidez tecidual geral. O pH cardíaco é um indicador valioso, pois o equilíbrio ácido-base é interrompido nos estágios iniciais de doenças cardíacas e condições como isquemia miocárdica, hipertrofia desadaptativa e insuficiência cardíaca6.
A produção de [1-13 C]lactato e [13 C]bicarbonato hiperpolarizados a partir do [1-13C]piruvato hiperpolarizado ajuda a determinar as taxas de produção de lactato desidrogenase (LDH) e piruvato desidrogenase (PDH). A maioria dos estudos prévios realizados utilizando substratos hiperpolarizados no coração de roedores isolados utilizou modelos cinéticos complexos para derivar a atividade enzimática da LDH e PDH, ou relatou as razões de intensidade de sinal do produto hiperpolarizado para um substrato sem calcular as taxas reais de atividade enzimática 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Aqui, utilizou-se a abordagem de saturação-excitação seletiva do produto 15, que permite o monitoramento da atividade enzimática de forma livre de modelos15,16. Desta forma, as taxas enzimáticas absolutas (ou seja, o número de moles de produto produzido por unidade de tempo) foram determinadas. 31 anos A espectroscopia P foi utilizada para observar os sinais de fosfato inorgânico (Pi), fosfocreatina (PCr) e trifosfato de adenosina (ATP). Uma análise multiparamétrica foi utilizada para caracterizar a distribuição do pH do coração, como demonstrado pelo deslocamento químico heterogêneo no sinal Pi do tecido.
O coração de rato retrógrado perfundido (coração de Langendorff)17,18,19 é um modelo ex vivo para o coração que bate intacto. Nesse modelo, a viabilidade cardíaca e o pH são preservados por pelo menos 80 min20, e tem demonstrado potencial de recuperação após lesão isquêmica prolongada21,22. No entanto, a variabilidade inadvertida durante a microcirurgia pode levar à variabilidade na viabilidade tecidual entre os corações. Estudos anteriores relataram a deterioração desse coração ao longo do tempo19; por exemplo, observou-se uma redução na função contrátil de 5%-10% por hora18. O sinal do trifosfato de adenosina (ATP) já demonstrou relatar o estado energético miocárdico e a viabilidade23. Aqui, observamos que o coração perfundido pode, ocasionalmente, apresentar variabilidade não intencional nos níveis de viabilidade, como demonstrado pelo teor de ATP, apesar de termos tido uma perfusão ininterrupta e suprimento de oxigênio. Demonstramos aqui que normalizar as taxas de LDH e PDH para o conteúdo de ATP do coração reduz a variabilidade intercardíaca nessas taxas.
No protocolo a seguir, descrevemos o procedimento cirúrgico utilizado para canulação cardíaca, isolamento e consequente perfusão no espectrômetro de RMN. Vale ressaltar que outras abordagens cirúrgicas com o objetivo de isolar e perfundir o coração de camundongos foram descritas antesde 24,25.
As metodologias utilizadas para a aquisição de dados relacionados às taxas enzimáticas no coração batendo (usando espectroscopia de 13 C e [1-13C]piruvato hiperpolarizado) e a viabilidade e acidez do coração (usando espectroscopia de RMN de 31P) também são descritas. Finalmente, as metodologias analíticas para determinar as atividades enzimáticas metabólicas e a viabilidade e acidez tecidual são explicadas.
Demonstramos uma configuração experimental projetada para investigar o metabolismo hiperpolarizado do [1-13C]piruvato, a energia tecidual e o pH em um modelo isolado de coração de camundongo.
As etapas críticas dentro do protocolo são as seguintes: 1) garantir que o pH do tampão seja de 7,4; 2) assegurar que todos os componentes da reserva sejam incluídos; 3) evitar a coagulação do sangue nos vasos cardíacos por injeções de heparina; 4) evitar danos isquêmicos ao cora?…
The authors have nothing to disclose.
Este projeto recebeu financiamento da Israel Science Foundation sob o contrato de subvenção nº 1379/18; a Bolsa Jabotinsky do Ministério da Ciência e Tecnologia de Israel para Ciências Aplicadas e de Engenharia para Estudantes de Doutorado Direto No. 3-15892 para D.S.; e o programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo da convenção de subvenção n.º 858149 (AlternativesToGd).
Equipment | |||
HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 52-ZNP91000 | HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer |
NMR spectrometer | RS2D | NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe | |
Peristaltic pump | Cole-Parmer | 07554-95 | |
Temperature probe | Osensa | FTX-100-LUX+ | NMR compatible temprature probe |
Somnosuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | ||
Lines, tubings, suture | |||
Platinum cured silicone tubes | Cole-Parmer | HV-96119-16 | L/S 16 I.D. 3.1 mm |
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines | Upchurch Scientific | id. 0.040” | |
Intravenous catheter | BD Medical | 381323 | 22 G |
Silk suture | Ethicon | W577H | Wire diameter of 3-0 |
Chemicals and pharmaceuticals | |||
[1-13C]pyruvic acid | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-8077-1 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | CAS: 10043-52-4 |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | CAS: 50-99-77 |
Heparin sodium | Rotexmedica | HEP5A0130C0160 | |
Hydrochloric acid 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | CAS: 7647-01-0 |
Insulin aspart (NovoLog) | Novo Nordisk | ||
Isoflurane | Terrel | ||
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 793612 | CAS: 7487-88-9 |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | CAS: 7447-40-7 |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | CAS: 7778-77-0 |
Sodium bicarbonate | Gadot Group | CAS: 144-55-8 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | CAS: 7647-14-5 |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 655104 | CAS: 1310-73-2 |
Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | CAS: 7558-79-4 |
Sodium phosphate monbasic dihydrate | Merck | 6345 | CAS: 13472-35-0 |
TRIS (biotechnology grade) | Amresco | 0826 | CAS: 77-86-1 |
Trityl radical OX063 | GE Healthcare AS | NC100136 | OX063 |
NMR standards | |||
13C standard sample | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-72A | 40% p-dioxane in benzene-D6 |
31P standard sample | Made in house | 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O | |
Software | |||
Excel 2016 | Microsoft | ||
MNova | Mestrelab Research |