Undersökning av hjärtmetabolism i det isolerade perfuserade mushjärtat med hyperpolariserat [1-13C] pyruvat och 13C/31P NMR-spektroskopi
Summary
Vi beskriver en experimentell uppställning för administrering av hyperpolariserade 13C-märkta metaboliter i kontinuerligt perfusionsläge till ett isolerat perfuserat mushjärta. En dedikerad 13C-NMR-förvärvsmetod möjliggjorde kvantifiering av metabolisk enzymaktivitet i realtid, och en multiparametrisk 31P-NMR-analys möjliggjorde bestämning av vävnadens ATP-innehåll och pH.
Abstract
Metabolism är grunden för viktiga processer i cellulärt liv. Att karakterisera hur metaboliska nätverk fungerar i levande vävnader ger viktig information för att förstå sjukdomsmekanismen och utforma behandlingar. I detta arbete beskriver vi procedurer och metoder för att studera metabolisk aktivitet i celler i ett retrograda perfuserat mushjärta i realtid. Hjärtat isolerades in situ, i samband med hjärtstillestånd för att minimera myokardischemi och perfuserades inuti en kärnmagnetisk resonans (NMR) spektrometer. Medan i spektrometern och under kontinuerlig perfusion administrerades hyperpolariserat [1-13 C] pyruvat till hjärtat, och de efterföljande hyperpolariserade [1-13C] laktat- och [13C] bikarbonatproduktionshastigheterna tjänade till att i realtid bestämma hastigheterna för laktatdehydrogenas och pyruvatdehydrogenasproduktion. Denna metaboliska aktivitet av hyperpolariserat [1-13C] pyruvat kvantifierades med NMR-spektroskopi på ett modellfritt sätt med hjälp av produktselektiv mättnad-excitationsförvärvsmetod. 31 P-spektroskopi tillämpades mellan de hyperpolariserade förvärven för att övervaka hjärtenergin och pH. Detta system är unikt användbart för att studera metabolisk aktivitet i det friska och sjuka mushjärtat.
Introduction
Förändringar i hjärtmetabolismen är förknippade med en mängd olika kardiomyopatier och utgör ofta grunden för de underliggande patofysiologiska mekanismerna1. Det finns dock många hinder för att studera metabolism i levande vävnader, eftersom de flesta biokemiska analyser kräver homogenisering av vävnads- och celllys och / eller radioaktiv spårning. Därför finns det ett pressande behov av nya verktyg för att undersöka myokardmetabolism i levande vävnader. Magnetisk resonans (MR) av hyperpolariserade 13C-märkta substrat möjliggör realtidsmätningar av metabolism i levande vävnader 2, utan användning av joniserande strålning, genom att öka MR-signal-brusförhållandet (SNR) för de märkta platsernamed flera storleksordningar3. Här beskriver vi en experimentell uppställning, en förvärvsmetod och en analytisk metod för att studera den snabba metabolismen i det isolerade mushjärtat och parallellt presentera indikatorer på allmän vävnadsenergi och surhet. Hjärtats pH är en värdefull indikator, eftersom syra-basbalansen störs i de tidiga stadierna av hjärtsjukdomar och tillstånd som myokardischemi, maladaptiv hypertrofi och hjärtsvikt6.
Hyperpolariserad [1-13 C] laktat och [13 C] bikarbonatproduktion från hyperpolariserad [1-13C] pyruvat hjälper till att bestämma produktionshastigheterna för laktatdehydrogenas (LDH) och pyruvatdehydrogenas (PDH). De flesta av de tidigare studierna som utförts med användning av hyperpolariserade substrat i det isolerade gnagarhjärtat använde antingen komplexa kinetiska modeller för att härleda den enzymatiska aktiviteten hos LDH och PDH, eller rapporterade signalintensitetsförhållandena för den hyperpolariserade produkten till ett substrat utan att beräkna de faktiska enzymaktivitetshastigheterna 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Här använde vi produktselektiva mättnad-excitationer metod 15, vilket möjliggör övervakning av enzymaktiviteten på ett modellfritt sätt15,16. På detta sätt bestämdes de absoluta enzymatiska hastigheterna (dvs antalet mol produkt som produceras per tidsenhet). 31 P-spektroskopi användes för att observera signalerna från oorganiskt fosfat (Pi), fosfokreatin (PCr) och adenosintrifosfat (ATP). En multiparametrisk analys användes för att karakterisera hjärtats pH-fördelning, vilket demonstrerades av den heterogena kemiska förskjutningen i vävnadens Pi-signal.
Det retrograda perfuserade mushjärtat (Langendorff-hjärtat)17,18,19 är en ex vivo-modell för det intakta bultande hjärtat. I denna modell bevaras hjärtviabiliteten och pH i minst 80 min20, och det har visat potential för återhämtning efter en långvarig ischemisk skada21,22. Icke desto mindre kan oavsiktlig variabilitet under mikrokirurgi leda till variationer i vävnadens livskraft över hjärtan. Tidigare studier har rapporterat om försämringen av detta hjärta över tid19; Till exempel har en minskning av kontraktil funktion med 5% -10% per timme observerats18. Adenosintrifosfatsignalen (ATP) har tidigare visat sig rapportera om myokardiell energistatus och livskraft23. Här noterade vi att det perfuserade hjärtat ibland kan visa oavsiktlig variation i livskraftsnivåer, vilket framgår av ATP-innehållet, trots att vi hade en oavbruten perfusion och syretillförsel. Vi visar här att normalisering av LDH- och PDH-hastigheterna till ATP-innehållet i hjärtat minskar variabiliteten mellan hjärtan i dessa hastigheter.
I följande protokoll beskriver vi det kirurgiska ingrepp som används för hjärtkannulation, isolering och därmed perfusion i NMR-spektrometern. Observera att andra kirurgiska metoder som syftar till att isolera och perfusera mushjärtat har beskrivits före24,25.
De metoder som används för att samla in data relaterade till enzymatiska hastigheter i det slående hjärtat (med hjälp av 13 C-spektroskopi och hyperpolariserat [1-13C] pyruvat) och hjärtats livskraft och surhet (med 31P NMR-spektroskopi) beskrivs också. Slutligen förklaras analysmetoderna för att bestämma metaboliska enzymaktiviteter och vävnadsviabilitet och surhet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi demonstrerar en experimentell uppställning som är utformad för att undersöka hyperpolariserad [1-13C] pyruvatmetabolism, vävnadsenergi och pH i en isolerad mushjärtmodell.
De kritiska stegen i protokollet är följande: 1) säkerställa att buffertens pH är 7,4; 2) se till att alla buffertkomponenter ingår, 3) undvika blodkoagulering i hjärtkärlen genom heparininjektioner; 4) undvika ischemisk skada på hjärtat genom att minska den metaboliska aktiviteten (KCl-injektio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt fick finansiering från Israel Science Foundation enligt bidragsavtal nr 1379/18; Jabotinsky-stipendiet från det israeliska ministeriet för vetenskap och teknik för tillämpad och ingenjörsvetenskap för direkta doktorander nr 3-15892 för DS; och Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 858149 (AlternativesToGd).
Materials
| Equipment | |||
| HyperSense DNP Polariser | Oxford Instruments | 52-ZNP91000 | HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer |
| NMR spectrometer | RS2D | NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | 07554-95 | |
| Temperature probe | Osensa | FTX-100-LUX+ | NMR compatible temprature probe |
| Somnosuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | ||
| Lines, tubings, suture | |||
| Platinum cured silicone tubes | Cole-Parmer | HV-96119-16 | L/S 16 I.D. 3.1 mm |
| Thin polyether ether ketone (PEEK) lines | Upchurch Scientific | id. 0.040” | |
| Intravenous catheter | BD Medical | 381323 | 22 G |
| Silk suture | Ethicon | W577H | Wire diameter of 3-0 |
| Chemicals and pharmaceuticals | |||
| [1-13C]pyruvic acid | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-8077-1 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 21074 | CAS: 10043-52-4 |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | CAS: 50-99-77 |
| Heparin sodium | Rotexmedica | HEP5A0130C0160 | |
| Hydrochloric acid 37% | Sigma-Aldrich | 258148 | CAS: 7647-01-0 |
| Insulin aspart (NovoLog) | Novo Nordisk | ||
| Isoflurane | Terrel | ||
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | 793612 | CAS: 7487-88-9 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P4504 | CAS: 7447-40-7 |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | CAS: 7778-77-0 |
| Sodium bicarbonate | Gadot Group | CAS: 144-55-8 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9625 | CAS: 7647-14-5 |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 655104 | CAS: 1310-73-2 |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | CAS: 7558-79-4 |
| Sodium phosphate monbasic dihydrate | Merck | 6345 | CAS: 13472-35-0 |
| TRIS (biotechnology grade) | Amresco | 0826 | CAS: 77-86-1 |
| Trityl radical OX063 | GE Healthcare AS | NC100136 | OX063 |
| NMR standards | |||
| 13C standard sample | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-72A | 40% p-dioxane in benzene-D6 |
| 31P standard sample | Made in house | 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O | |
| Software | |||
| Excel 2016 | Microsoft | ||
| MNova | Mestrelab Research |
References
- Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
- Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
- Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
- Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
- Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
- Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
- Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
- Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
- Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
- Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
- Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
- Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
- Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
- Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
- Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
- Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
- Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff’s isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
- Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury – A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
- Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
- Clarke, K., O’Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
- Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
- Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
- Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
- Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
- Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
- Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
- Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model – ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
- Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
- Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
- Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
- Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
- Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
- Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
- Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
- Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
- Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
- Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
- Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
- Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
- Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
- Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).
