Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie [1-13 C] pyruvaat en 13C / 31P NMR-spectroscopie

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63188

⸱

21 april 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een experimentele opstelling voor het toedienen van hyperpolarized 13C-gelabelde metabolieten in continue perfusiemodus aan een geïsoleerd geperfuseerd muizenhart. Een speciale 13C-NMR-acquisitiebenadering maakte de kwantificering van metabole enzymactiviteit in realtime mogelijk, en een multiparametrische 31P-NMR-analyse maakte de bepaling van het atp-gehalte en de pH van het weefsel mogelijk.

Samenvatting

Metabolisme is de basis van belangrijke processen in het cellulaire leven. Het karakteriseren van hoe metabole netwerken functioneren in levende weefsels biedt cruciale informatie voor het begrijpen van het mechanisme van ziekten en het ontwerpen van behandelingen. In dit werk beschrijven we procedures en methodologieën voor het bestuderen van in-cell metabole activiteit in een retrograde geperfuseerd muizenhart in real-time. Het hart werd geïsoleerd in situ, in combinatie met een hartstilstand om de myocardiale ischemie te minimaliseren en werd geperfundeerd in een nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectrometer. Terwijl in de spectrometer en onder continue perfusie, hyperpolarized [1-13C] pyruvaat werd toegediend aan het hart, en de daaropvolgende hyperpolarized [1-13 C] lactaat en [13C] bicarbonaat productiesnelheden dienden om, in real-time, de snelheden van lactaatdehydrogenase en pyruvaatdehydrogenase productie te bepalen. Deze metabole activiteit van hyperpolarized [1-13C] pyruvaat werd gekwantificeerd met NMR-spectroscopie op een modelvrije manier met behulp van de productselectieve verzadiging-excitatie-acquisitiebenadering. 31 P-spectroscopie werd toegepast tussen de hyperpolarisatie-acquisities om de cardiale energetica en pH te controleren. Dit systeem is uniek nuttig voor het bestuderen van metabole activiteit in het gezonde en zieke muizenhart.

Inleiding

Veranderingen in het hartmetabolisme zijn geassocieerd met een verscheidenheid aan cardiomyopathieën en vormen vaak de basis van de onderliggende pathofysiologische mechanismen1. Er zijn echter tal van obstakels voor het bestuderen van het metabolisme in levende weefsels, omdat de meeste biochemische testen de homogenisatie van het weefsel en de cellyse en / of radioactieve tracering vereisen. Daarom is er een dringende behoefte aan nieuwe hulpmiddelen om het myocardiale metabolisme in levende weefsels te onderzoeken. Magnetische resonantie (MR) van hyperpolariseerde 13C-gelabelde substraten maakt real-time metingen van het metabolisme in levende weefsels2 mogelijk, zonder het gebruik van ioniserende straling, door de MR-signaal-ruis (SNR) -verhouding van de gelabelde plaats (en) met verschillende ordes van grootte3 te verhogen. Hier beschrijven we een experimentele opstelling, een acquisitiebenadering en een analytische benadering voor het bestuderen van het snelle metabolisme in het geïsoleerde muizenhart en, parallel daaraan, presenterende indicatoren van algemene weefselenergetica en zuurgraad. De cardiale pH is een waardevolle indicator, omdat de zuur-base balans wordt verstoord in de vroege stadia van hartaandoeningen en aandoeningen zoals myocardiale ischemie, onaangepaste hypertrofie en hartfalen6.

Hyperpolarized [1-13 C]lactaat en [13 C]bicarbonaat productie uit hyperpolarized [1-13C]pyruvaat helpt bij het bepalen van de productiesnelheden van lactaatdehydrogenase (LDH) en pyruvaatdehydrogenase (PDH). De meeste eerdere studies uitgevoerd met behulp van hyperpolariseerde substraten in het geïsoleerde knaagdierhart gebruikten ofwel complexe kinetische modellen om de enzymatische activiteit van LDH en PDH af te leiden, of rapporteerden de signaalintensiteitsverhoudingen van het hyperpolariseerde product naar een substraat zonder de werkelijke enzymactiviteitssnelheden 2,4,5,6,7,8,9,10 te berekenen, 11,12,13,14. Hier gebruikten we de productselectieve verzadigings-excitatiebenadering 15, die het mogelijk maakt om de enzymactiviteit op een modelvrije manier te monitoren15,16. Op deze manier werden de absolute enzymatische snelheden (d.w.z. het aantal mol geproduceerd product per tijdseenheid) bepaald. 31 P-spectroscopie werd gebruikt om de signalen van anorganisch fosfaat (Pi), fosfocreatine (PCr) en adenosinetrifosfaat (ATP) te observeren. Een multiparametrische analyse werd gebruikt om de pH-verdeling van het hart te karakteriseren, zoals aangetoond door de heterogene chemische verschuiving in het Pi-signaal van het weefsel.

Het retrograde doordrenkte muizenhart (Langendorffhart)17,18,19 is een ex vivo model voor het intacte kloppende hart. In dit model worden de levensvatbaarheid van het hart en de pH gedurende ten minste 80 min20 behouden en heeft het potentieel voor herstel aangetoond na een langdurig ischemisch letsel21,22. Niettemin kan onbedoelde variabiliteit tijdens microchirurgie leiden tot variabiliteit in de levensvatbaarheid van het weefsel over de harten. Eerdere studies hebben gerapporteerd over de verslechtering van dit hart in de loop van de tijd19; Er is bijvoorbeeld een vermindering van de contractiele functie van 5% -10% per uur waargenomen18. Van het adenosinetrifosfaat (ATP) signaal is eerder aangetoond dat het rapporteert over de myocardiale energetische status en levensvatbaarheid23. Hier merkten we op dat het doordrenkte hart af en toe onbedoelde variabiliteit in levensvatbaarheidsniveaus kan vertonen, zoals aangetoond door het ATP-gehalte, ondanks het feit dat we een ononderbroken perfusie en zuurstoftoevoer hadden. We tonen hier aan dat het normaliseren van de LDH- en PDH-snelheden naar het ATP-gehalte van het hart de interhartvariabiliteit in deze snelheden vermindert.

In het volgende protocol beschrijven we de chirurgische procedure die wordt gebruikt voor hartcannulatie, isolatie en daaruit voortvloeiende perfusie in de NMR-spectrometer. Van belang is dat andere chirurgische benaderingen gericht op het isoleren en perfuseren van het muizenhart zijn beschreven vóór24,25.

De methodologieën die worden gebruikt voor het verkrijgen van gegevens met betrekking tot enzymatische snelheden in het kloppende hart (met behulp van 13 C-spectroscopie en hyperpolarisatie [1-13C] pyruvaat) en de levensvatbaarheid en zuurgraad van het hart (met behulp van 31P NMR-spectroscopie) worden ook beschreven. Ten slotte worden de analysemethoden voor het bepalen van metabole enzymactiviteiten en de levensvatbaarheid en zuurgraad van weefsel uitgelegd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De gezamenlijke ethische commissie (IACUC) van de Hebreeuwse Universiteit en het Hadassah Medical Center keurden het studieprotocol voor dierenwelzijn goed (MD-19-15827-1).

1. Krebs-Henseleit buffervoorbereiding

  1. Maak een dag voor het experiment een aangepaste versie van de Krebs-Henseleit-buffer (KHB)26. Los in eerste instantie 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM pyruvaat, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 en 1,2 mM KH 2 PO4 op in dubbel gedestilleerd H2O.
  2. Blaas dit mengsel met 95%/5% O 2/CO 2 gedurende 20 minuten en voeg vervolgens 1,2 mM CaCl2 toe.
  3. Stel de pH van de buffer in op 7,4 met HCl of NaOH.
  4. Voeg op de dag van het experiment 10 mM glucose en 72 U/L insuline toe aan de KHB bereid in stap 1.2.
    OPMERKING: Insuline wordt toegevoegd aan de perfusiebuffer zoals beschreven in het werk van Kolwicz et al.26 en in overeenstemming met eerdere studies die melden dat insuline de contractiele functieverhoogt 27 en de intensiteit van het hyperpolarized [13C] bicarbonaatsignaal 28.

2. Voorbereiding van het perfusiesysteem

  1. Bewaar een reservoir van 200 ml KHB in een waterbad bij 40 °C en bel met 95%/5% O 2/CO2 bij een stroomsnelheid van 4 l/min gedurende 1 uur voorafgaand aan hartperfusie. Houd de buffer gedurende het hele experiment continu borrelend met dit gasmengsel.
    1. Stel eerst het waterbad in op 40 °C. Plaats het KHB-reservoir. Gebruik een peristaltische pomp (zie materiaaltabel) en verlengbuizen van medische kwaliteit om de KHB tussen het bufferreservoir en de 10 mm NMR-buis te recirculeren met een constant debiet van 7,5 ml / min.
    2. Sluit drie platina uitgeharde siliconenbuizen (3 mm i.d.) aan op de pomp (één instroombuis en twee uitstroombuizen voor de KH-buffer). Plaats de uitstroom- en instroomleidingen in de verwarmde KH-buffer. Steek vervolgens de zuurstofleiding in de verwarmde KH-buffer.
    3. Gebruik dunne polyetheretherketon (PEEK, zie tabel met materialen) lijnen voor de buffer en het hypergepolariseerde middel om van en naar de NMR-buis in de boring van de spectrometer te stromen.
  2. Zorg ervoor dat de temperatuur op 37-37,5 °C wordt gehouden. Volg de onderstaande stappen.
  3. Wikkel de instroomleiding (van het bufferreservoir naar de NMR-buis) met een verwarmingstape die is ingesteld op 42 °C.
  4. Verwarm de NMR-buis in de spectrometer met een warme luchtstroom die wordt geregeld door de spectrometer.
  5. Gebruik een NMR-compatibele temperatuursensor (zie materiaaltabel) om de temperatuur in de NMR-buis te meten. De temperatuur wordt ingesteld op 37-37,5 °C.

3. Kalibratie en voorbereiding van de NMR-spectrometer voor acquisitie

  1. Plaats op de dag van het experiment een standaardmonster van 13 C dat 1,4-dioxaan (materiaaltabel) bevat in de spectrometer en stem de NMR-sonde af en match deze voor 13C. Verkrijg vervolgens een spectrum met het thermisch evenwichtssignaal van 1,4-dioxaan met een nutatiehoek van 90°.
  2. Vervang nu het 13C-standaardmonster met een 31 P-standaardmonster (materiaaltabel), dat 105 mM ATP bevat in D2O. Stem af en match de NMR-sonde voor 31P.
    OPMERKING: Een spectrum dat de fosfaatsignalen van het thermisch evenwicht weergeeft, wordt verkregen met een nutatiehoek van 50°.
  3. Plaats de instroomleiding, de uitstroomleiding en de temperatuurvoeler in een NMR-buis van 10 mm en steek de buis vervolgens in de magnetische boring. Stel de verwarmingsband in op 42 °C.
  4. Verkrijg een 31P NMR-spectrum van de circulerende KH-buffer om gedurende 30 minuten in dat experiment te worden gebruikt, met een nutatiehoek van 50 ° en een TR van 1,1 s (1.640 acquisities).

4. Diervoorbereiding, chirurgische procedure en perfusie van het hart in de NMR-buis

  1. Verdoof een mannelijke HSD:ICR (CD-1) muis met 3,3% isofluraan in kamerlucht (Materiaalopgave) bij 340 ml/min gedurende 5 minuten met behulp van een gasanesthesiesysteem (Materiaaltafel) in een inductiekamer.
  2. Gebruik nasale anesthesie voor het onderhoud van algemene anesthesie met 2,9% isofluraan.
    OPMERKING: Er wordt voor gezorgd dat pijn en ongemak voor het dier tot een minimum worden beperkt.
  3. Bevestig de ledematen van het dier met tape, zorg voor een negatieve pedaalpijnreflex en injecteer vervolgens 300 IE natriumheparine intraperitoneaal.
  4. Maak de borstwand en buik van de muis grondig nat met 70% alcohol om reinheid te garanderen en haarbesmetting of obstructie tijdens de chirurgische ingreep te voorkomen.
  5. Knip 1 minuut na de heparine-injectie de huid en spieren van de buikholte af met een kleine schaar.
  6. Plaats de kleine hemostat-locking muggenklem met gebogen kaak tussen het xiphoid-proces en de borsthuid om de borstkas op te tillen en het middenrif bloot te leggen. Prik en snijd de rechterkwab van het middenrif.
  7. Snijd de borst over de middellijn, trek je terug naar de zijkanten en verwijder vervolgens.
  8. Injecteer de linker ventrikel van het hart met 200 IE natriumheparine om bloedstolling te voorkomen. Injecteer vervolgens 0,1 ml ijskoude 0,5 mol/L KCl om een hartstilstand te krijgen, zoals eerder beschreven25. Een hartstilstand is essentieel om het hart te kunnen cannuleren.
  9. Identificeer de thymus en verwijder deze met een schaar om de aorta bloot te leggen. Verwijder resterend ribbenkastweefsel.
  10. Identificeer de aortaboog en gebruik een gebogen tang om een losse knoop met een 3-0 zijden hechtdraad (Table of Materials) rond de opgaande aorta te plaatsen. Injecteer 3 ml KHB in de linker ventrikel om bloedstolsels uit de aorta te verwijderen.
  11. Gebruik een gebogen tang om het hart inferieur in te trekken voor een betere visualisatie van de opstijgende aorta.
  12. Voer cannulatie in situ uit met een intraveneuze katheter van 22 G (materiaaltabel). Breng cyanoacrylaatlijm aan in het gecannuleerde gebied en voer vervolgens dubbele hechtdraadbinding uit. Injecteer extra KH-buffer in het hart en controleer of deze door de cannulatiebuis stroomt.
  13. Verwijder de gebogen tang. Koppel het hart los van de omringende ingewanden en doordrenk het retrograde met ijskoude KHB (4 °C) via de intraveneuze katheter.
  14. Verbind het hart met de instroomlijn van het perfusiesysteem via de intraveneuze katheter. Bij het begin van de perfusie met warme buffer (37-37,5 °C) bij 7,5 ml / min begint het hart spontaan te kloppen.
  15. Bevestig de NMR-buis met het kloppende hart, de uitstroomlijnen en de temperatuursonde en steek deze in de boring van de spectrometer, zodat het hart zich in het midden van de NMR-sonde bevindt.

5. Het verzamelen van gegevens voor cardiale energetica en pH

  1. Verkrijg 31P spectra gedurende ongeveer 1 uur met een fliphoek van 50 ° en een TR van 1,1 s.

6. DNP-spinpolarisatie en -oplossing

  1. Bereid een 28,5 mg formulering van [1-13C] pyruvaat. Deze formulering bestaat uit 11,1 mM tot 14,0 mM OX063 radicaal in het nette zuur.
  2. Bereid 4 ml oplosmiddel. Het oplosmedium bestaat uit TRIS-fosfaatbuffer, die 11,2 mM NaH 2 PO 4, 38,8 mM Na 2 HPO4, 33 mM TRIS en2mM HCl bevat. Deze mediumsamenstelling wordt zodanig aangepast dat bij toevoeging van 28,5 mg [1-13C] pyruvinezuurformulering aan 4 ml van deze buffer (in de oplosfase), de pH van de resulterende oplossing 7,4 zal zijn.
  3. Voer spinpolarisatie en snelle oplossing uit in een ontbindings-DNP (dDNP) spinpolarisatieapparaat volgens de instructies van de fabrikant (materiaaltabel). Breng microgolfbestraling aan met een frequentie van 94,110 GHz voor de polarisatie van de [1-13C] pyruvinezuurformulering bij 1,45 K tot 1,55 K gedurende ongeveer 1,5 uur.
  4. Meng snel de 4 ml hypergepolariseerd medium van het dDNP-apparaat met een goed geoxygeneerde oplossing die het hypergepolariseerde oplosmedium aanvult om een samenstelling te verkrijgen die nauw aansluit bij het perfusiemedium.
    OPMERKING: Het uiteindelijke volume van het medium dat het hart doordrenkt tijdens de hyperpolarisatie-injecties met 14 mM hyperpolarized [1-13C] pyruvaat is 26 ml. De uiteindelijke samenstelling van het geïnjecteerde medium (na mengen) bevat 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM glucose, 1,2 mM CaCl2en 72 U/L insuline.
  5. Dien het hyperpolarized [1-13C]pyruvaatbevattende medium toe aan het geïsoleerde hart met behulp van een continue stroomopstelling29.
    OPMERKING: Dit wordt gedaan om ervoor te zorgen dat de hartperfusie op geen enkel moment tijdens het experiment wordt verstoord en dat het hyperpolariseerde medium wordt toegediend met een bekende snelheid en voor een bekende duur.

7. Hyperpolarized 13C spectroscopie

  1. Verkrijg hyperpolarized 13C-gegevens met behulp van productselectieve verzadigings-excitatiepulsen 15 door 2,5 ms kardinale sinus (Sinc) pulsen toe te passen, zoals eerder beschreven15,16. Prikkel selectief [1-13 C]lactaat en [13C]bicarbonaat achtereenvolgens met intervallen van 6 s om een interval van 12s voor elke metaboliet te verkrijgen.
  2. Voor [1-13 C]lactaatdetectie centreert u de selectieve Sinc-puls op de [1-13 C]pyruvaathydraatfrequentie (179,4 ppm), wat resulteert in een signaalintensiteitsverhouding (lac) van 0,113 voor de C 1-signalen van [1-13 C]pyruvaat tot [1-13C]lactaat.
  3. Voor [13 C]bicarbonaatdetectie centreert u de selectieve Sinc-puls op 157,7 ppm, wat neerwaarts 214 Hz is van het [13C]bicarbonaatsignaal (161,1 ppm); dit resulteert in een signaalintensiteitsverhouding (bic) van 0,139 voor het C 1-signaal van [1-13C]pyruvaat tot [13C]bicarbonaat.

8. Bepaling van het natte gewicht en volume van het weefsel

  1. Maak aan het einde van het experiment het hart los van het perfusiesysteem en droog het voorzichtig af met tissuepapier. Weeg vervolgens het hart om het natte gewicht van het weefsel te verkrijgen.
  2. Bepaal het volume van het hart met behulp van een dichtheidsfactor van 1,05 g/cm3, zoals eerder bepaald voor het muizenhart30.

9. Kwantificering van het ATP-gehalte

  1. Integreer het γ-ATP-signaal van een enkele acquisitie van het ATP-standaardmonster en een 30 minuten acquisitie (TR van 1,1 s en 1.640 acquisities) van het geïsoleerde hart.
  2. Kwantificeer het ATP-gehalte van het hart door de integraal van het γ-ATP-signaal van het hart te vergelijken met die van de standaard (Tabel van Materialen), waar deze laatste een bekende concentratie heeft (105 mM), en corrigeer voor het aantal acquisities en ontspanningseffecten.

10. Het oplossen van het Pi-signaal van het hart

OPMERKING: Om de pH van het weefsel te evalueren, is het eerst nodig om het Pi-signaal van het hart te deconvolveren van dat van het totale Pi-signaal (Pit). Dit wordt gedaan door het signaal van de KHB Pi (PiKH) weg te laten van dat van de Pit.

  1. In een 31P-spectrum van KHB dat een enkel Pi-signaal toont (PiKH, Figuur 1A), past u het PiKH-signaal aan op een Lorentzian-functie met behulp van Excel (Table of Materials).
  2. Het volume dat zichtbaar is voor de NMR-sonde (Vp, 1,375 ml), bevat meer KHB wanneer de monsterbuis het hart niet bevat. Om voor dit vuleffect te corrigeren, berekent u het verzwakte buffersignaal (Pib) met behulp van Eq. 1A.
    figure-protocol-1Eq. 1A
    waarbij Vh het volume van het hart is, zoals bepaald in stap 8.
  3. Trek dit signaal af van de Pit volgens Eq. 1B om het Pi-signaal te verkrijgen dat uitsluitend afkomstig is van het doordrenkte hart (Pih, figuur 1B).
    figure-protocol-2Eq. 1B

11. Multiparametrische pH-analyse

  1. Voer de conversie uit van de chemische verschuivingsverdeling van het Pih-signaal naar de pH met betrekking tot de chemische verschuiving van PCr met behulp van Eq. 231.
    figure-protocol-3Eq. 2
    waarbij Δδ het chemische verschuivingsverschil is, pKa 6,72, δ vrije base 5,69 en δ vrij zuur 3,27 is, zoals eerder beschreven31.
  2. Corrigeer de resulterende pH-verdelingscurve voor de niet-lineariteit tussen de Pih chemische verschuivingsschaal en de pH-schaal volgens Lutz et al.32. Een typische pH-verdeling die uit deze berekening voortvloeit, is weergegeven in figuur 1C.
  3. Analyseer de pH-verdeling van het weefsel met een multiparametrische benadering met behulp van zeven statistische parameters volgens het werk van Lutz et al. 32. Vier van deze parameters worden hier gepresenteerd, aangezien zij de meest beschrijvende van de weefsel-pH lijken te zijn: 1) globale maximale pH; 2) gewogen gemiddelde pH; 3) gewogen mediane pH; en 4) scheefheid van de pH-plot (figuur 1C).

12. Berekening van de LDH- en PDH-activiteiten

OPMERKING: De productiesnelheden van de hyperpolariseerde metabolieten [1-13 C]lactaat en [13C]bicarbonaat worden gebruikt om respectievelijk de LDH- en PDH-activiteiten te berekenen. In de productselectieve verzadigings-excitatiebenadering15 worden alleen nieuw gesynthetiseerde hyperpolariseerde metabolieten gedetecteerd door elke selectieve excitatie.

  1. Gebruik het hyperpolarized [1-13C]pyruvaatsignaal als referentie om het overeenkomstige metabolietproductieniveau te bepalen.
    1. Tijdens de perfusie met het hypergepolariseerde medium neemt de [1-13 C]pyruvaatconcentratie in de NMR-buis toe (wash-in), vervolgens plateaus (bij een maximale concentratie van 14mM) en neemt vervolgens af (wash-out).
    2. Om de tijdstippen te identificeren waarop de pyruvaatconcentratie een constant niveau (plateau) bereikte, corrigeert u het [1-13C] pyruvaatsignaal voor signaalverval als gevolg van T1-relaxatie en RF-pulsatie met behulp van de effectieve relaxatieconstante, Teff.
    3. Definieer voor elke injectie de Teff op basis van zijn vermogen om de [1-13C]pyruvaatvervalcurve te corrigeren om deze stromingsdynamiek weer te geven (Eq.3).
      figure-protocol-4Eq. 3
      waar figure-protocol-5 het [1-13 C]pyruvaatsignaal is dat werd verkregen tijdens de [13C]bicarbonaatacquisitie. De gemiddeldeT-eff in de hierin beschreven experimenten bleek 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 harten) te zijn.
    4. Selecteer de gegevenspunten waarin de concentratie binnen 10% van het maximaal gecorrigeerde [1-13C] pyruvaatsignaal ligt voor verdere analyse.
  2. Gebruik de overeenkomstige gegevens van [1-13 C]lactaat- en [13C]bicarbonaatproductie voor de in stap 12.1geselecteerde tijdstippen voor de berekening van de metabolietproductiesnelheden met behulp van Eq. 4A en Eq. 4B, op voorwaarde dat de SNR van het metabolietsignaal groter is dan 2 (drempel voor analyse). Een typisch voorbeeld van een dergelijke selectie van tijdspunten wordt weergegeven in figuur 2B (gemarkeerd temporeel venster).
  3. Bereken de productiesnelheden van elk van de geselecteerde gegevenspunten met behulp van Eq. 4A en Eq. 4B:
    figure-protocol-6Eq. 4A
    figure-protocol-7Eq. 4B
    waarbij figure-protocol-8 en zijn de productiesnelheden van respectievelijk [1-13C]lactaat of [13 C]bicarbonaat op elk tijdstip. en zijn factoren die de relatieve excitatie van respectievelijk [1-13 C]pyruvaat en figure-protocol-9 de producten [1-13 C]lactaat of [13C]bicarbonaat vertegenwoordigen. figure-protocol-10 figure-protocol-11 Deze factoren werden eerder bepaald op respectievelijk 0,113 en 0,13929. Vp is het volume dat wordt gedetecteerd door de NMR-sonde (1,375 ml), TR geeft het tijdsinterval aan tussen twee opeenvolgende productselectieve verzadigingsexcitaties (12 s voor elk product), figure-protocol-12 en zijn de signalen van respectievelijk [1-13C]lactaat en [13 C]bicarbonaat, en en zijn de signalen van [1-13 C]pyruvaat die werden verkregen tijdens het [1-13 C]lactaat en figure-protocol-13 figure-protocol-14 figure-protocol-15 [13 C]bicarbonaat excitaties, respectievelijk. [Pyr] is de [1-13C]pyruvaatconcentratie, die 14 mM was tijdens de plateaufase.
    1. Bepaal de snelheid voor elk punt en vervolgens het gemiddelde per hypergepolariseerde injectie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De 31P-spectra die zijn geregistreerd van een muizenhart doordrenkt met KHB en van de buffer alleen zijn weergegeven in figuur 1A. De signalen van α-, β- en γ-ATP, PCr en Pi werden waargenomen in het hart. Het Pi-signaal bestond uit twee hoofdcomponenten: in het hogere veld (linkerkant van het signaal) was het Pi-signaal vooral te wijten aan de KHB bij een pH van 7,4; in het onderste veld (rechterkant van het signaal) was het Pi-signaal breder en minder homogeen door de zuurdere o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We demonstreren een experimentele opstelling die is ontworpen om hyperpolarized [1-13C] pyruvaatmetabolisme, weefsel-energetica en pH te onderzoeken in een geïsoleerd muizenhartmodel.

De kritieke stappen binnen het protocol zijn als volgt: 1) ervoor zorgen dat de pH van de buffer 7,4 is; 2) ervoor zorgen dat alle componenten van de buffer worden opgenomen; 3) het vermijden van bloedstolling in de hartvaten door heparine-injecties; 4) het vermijden van ischemische schade aan het hart...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er zijn geen onthullingen.

Dankbetuigingen

Dit project ontving financiering van de Israel Science Foundation onder subsidieovereenkomst nr. 1379/18; de Jabotinsky-beurs van het Israëlische ministerie van Wetenschap en Technologie voor toegepaste en technische wetenschappen voor directe promovendi nr. 3-15892 voor DS; en het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 858149 (AlternativesToGd).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Uitrusting
HyperSense DNP PolariserOxford Instruments52-ZNP91000HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer RS2DNMR Cube, 5.8 T, uitgerust met een 10 mm breedbandsonde
Peristaltische pomp Cole-Parmer07554-95
TemperatuursondeOsensaFTX-100-LUX+NMR-compatibele temperatuur sonde
Somnosuite laag-flow anesthesie systeemKent Scientific
Lijnen, slangen, hechtdraad
Platinakuur siliconen slangenCole-ParmerHV-96119-16L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Dunne polyether ether ketone (PEEK) lijnenUpchurch Scientificid. 0.040”
Intraveneuze katheter BD Medical38132322 G
Zijde hechtdraadEthiconW577HDraadmikt van 3-0
Chemie en farmaceutische producten
[1-13C]pyruvinezuurCambridge Isotope LaboratoriesCLM-8077-1
CalciumchlorideSigma-Aldrich21074CAS: 10043-52-4
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528CAS: 50-99-77
Heparine natriumRotexmedicaHEP5A0130C0160
Zoutzuur 37%Sigma-Aldrich258148CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog)Novo Nordisk
IsofluraanTerrel
MagnesiumsulfaatSigma-Aldrich793612CAS: 7487-88-9
KaliumchlorideSigma-AldrichP4504CAS: 7447-40-7
Kaliumfosfaat monobasischSigma-AldrichP9791CAS: 7778-77-0
NatriumbicarbonaatGadot GroupCAS: 144-55-8
NatriumchlorideSigma-AldrichS9625CAS: 7647-14-5
NatriumhydroxideSigma-Aldrich655104CAS: 1310-73-2
Natriumfosfaat dibasischSigma-AldrichS7907CAS: 7558-79-4
Natriumfosfaat monobasisch dihydraatMerck6345CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnologie kwaliteit)Amresco0826CAS: 77-86-1
Trityl radicaal OX063GE Healthcare ASNC100136OX063
NMR standaarden
13C standaard monsterCambridge Isotope LaboratoriesDLM-72A40% p-dioxaan in benzeen-D6
31P standaard monsterIn house gemaakt105 mM ATP en 120 mM fenylfosfonzuur in D2O
Software
Excel 2016Microsoft
MNovaMestrelab Research

Referenties

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189(2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444(2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605(2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff's isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury - A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O'Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497(2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433(2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069(2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43(2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model - ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089(2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658(2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617(2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Hypergepolariseerd pyruvaatkoolstof-13-spectroscopiefosfor-31-spectroscopiepyruvaatmetabolismelactaatdehydrogenasepyruvaatdehydrogenasecardiale energetica
Onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie [1-13 C] pyruvaat en 13C / 31P NMR-spectroscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.