JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Onderzoek naar hartmetabolisme in het geïsoleerde geperfuseerde muizenhart met hyperpolarisatie [1-13 C] pyruvaat en 13C / 31P NMR-spectroscopie

Published: April 21, 2023
doi:
10.3791/63188
, , , , ,
1Department of Radiology, Hadassah Medical Organization and Faculty of Medicine,Hebrew University of Jerusalem, 2The Wohl Institute for Translational Medicine

Summary

We beschrijven een experimentele opstelling voor het toedienen van hyperpolarized 13C-gelabelde metabolieten in continue perfusiemodus aan een geïsoleerd geperfuseerd muizenhart. Een speciale 13C-NMR-acquisitiebenadering maakte de kwantificering van metabole enzymactiviteit in realtime mogelijk, en een multiparametrische 31P-NMR-analyse maakte de bepaling van het atp-gehalte en de pH van het weefsel mogelijk.

Abstract

Metabolisme is de basis van belangrijke processen in het cellulaire leven. Het karakteriseren van hoe metabole netwerken functioneren in levende weefsels biedt cruciale informatie voor het begrijpen van het mechanisme van ziekten en het ontwerpen van behandelingen. In dit werk beschrijven we procedures en methodologieën voor het bestuderen van in-cell metabole activiteit in een retrograde geperfuseerd muizenhart in real-time. Het hart werd geïsoleerd in situ, in combinatie met een hartstilstand om de myocardiale ischemie te minimaliseren en werd geperfundeerd in een nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectrometer. Terwijl in de spectrometer en onder continue perfusie, hyperpolarized [1-13C] pyruvaat werd toegediend aan het hart, en de daaropvolgende hyperpolarized [1-13 C] lactaat en [13C] bicarbonaat productiesnelheden dienden om, in real-time, de snelheden van lactaatdehydrogenase en pyruvaatdehydrogenase productie te bepalen. Deze metabole activiteit van hyperpolarized [1-13C] pyruvaat werd gekwantificeerd met NMR-spectroscopie op een modelvrije manier met behulp van de productselectieve verzadiging-excitatie-acquisitiebenadering. 31 P-spectroscopie werd toegepast tussen de hyperpolarisatie-acquisities om de cardiale energetica en pH te controleren. Dit systeem is uniek nuttig voor het bestuderen van metabole activiteit in het gezonde en zieke muizenhart.

Introduction

Veranderingen in het hartmetabolisme zijn geassocieerd met een verscheidenheid aan cardiomyopathieën en vormen vaak de basis van de onderliggende pathofysiologische mechanismen1. Er zijn echter tal van obstakels voor het bestuderen van het metabolisme in levende weefsels, omdat de meeste biochemische testen de homogenisatie van het weefsel en de cellyse en / of radioactieve tracering vereisen. Daarom is er een dringende behoefte aan nieuwe hulpmiddelen om het myocardiale metabolisme in levende weefsels te onderzoeken. Magnetische resonantie (MR) van hyperpolariseerde 13C-gelabelde substraten maakt real-time metingen van het metabolisme in levende weefsels2 mogelijk, zonder het gebruik van ioniserende straling, door de MR-signaal-ruis (SNR) -verhouding van de gelabelde plaats (en) met verschillende ordes van grootte3 te verhogen. Hier beschrijven we een experimentele opstelling, een acquisitiebenadering en een analytische benadering voor het bestuderen van het snelle metabolisme in het geïsoleerde muizenhart en, parallel daaraan, presenterende indicatoren van algemene weefselenergetica en zuurgraad. De cardiale pH is een waardevolle indicator, omdat de zuur-base balans wordt verstoord in de vroege stadia van hartaandoeningen en aandoeningen zoals myocardiale ischemie, onaangepaste hypertrofie en hartfalen6.

Hyperpolarized [1-13 C]lactaat en [13 C]bicarbonaat productie uit hyperpolarized [1-13C]pyruvaat helpt bij het bepalen van de productiesnelheden van lactaatdehydrogenase (LDH) en pyruvaatdehydrogenase (PDH). De meeste eerdere studies uitgevoerd met behulp van hyperpolariseerde substraten in het geïsoleerde knaagdierhart gebruikten ofwel complexe kinetische modellen om de enzymatische activiteit van LDH en PDH af te leiden, of rapporteerden de signaalintensiteitsverhoudingen van het hyperpolariseerde product naar een substraat zonder de werkelijke enzymactiviteitssnelheden 2,4,5,6,7,8,9,10 te berekenen, 11,12,13,14. Hier gebruikten we de productselectieve verzadigings-excitatiebenadering 15, die het mogelijk maakt om de enzymactiviteit op een modelvrije manier te monitoren15,16. Op deze manier werden de absolute enzymatische snelheden (d.w.z. het aantal mol geproduceerd product per tijdseenheid) bepaald. 31 P-spectroscopie werd gebruikt om de signalen van anorganisch fosfaat (Pi), fosfocreatine (PCr) en adenosinetrifosfaat (ATP) te observeren. Een multiparametrische analyse werd gebruikt om de pH-verdeling van het hart te karakteriseren, zoals aangetoond door de heterogene chemische verschuiving in het Pi-signaal van het weefsel.

Het retrograde doordrenkte muizenhart (Langendorffhart)17,18,19 is een ex vivo model voor het intacte kloppende hart. In dit model worden de levensvatbaarheid van het hart en de pH gedurende ten minste 80 min20 behouden en heeft het potentieel voor herstel aangetoond na een langdurig ischemisch letsel21,22. Niettemin kan onbedoelde variabiliteit tijdens microchirurgie leiden tot variabiliteit in de levensvatbaarheid van het weefsel over de harten. Eerdere studies hebben gerapporteerd over de verslechtering van dit hart in de loop van de tijd19; Er is bijvoorbeeld een vermindering van de contractiele functie van 5% -10% per uur waargenomen18. Van het adenosinetrifosfaat (ATP) signaal is eerder aangetoond dat het rapporteert over de myocardiale energetische status en levensvatbaarheid23. Hier merkten we op dat het doordrenkte hart af en toe onbedoelde variabiliteit in levensvatbaarheidsniveaus kan vertonen, zoals aangetoond door het ATP-gehalte, ondanks het feit dat we een ononderbroken perfusie en zuurstoftoevoer hadden. We tonen hier aan dat het normaliseren van de LDH- en PDH-snelheden naar het ATP-gehalte van het hart de interhartvariabiliteit in deze snelheden vermindert.

In het volgende protocol beschrijven we de chirurgische procedure die wordt gebruikt voor hartcannulatie, isolatie en daaruit voortvloeiende perfusie in de NMR-spectrometer. Van belang is dat andere chirurgische benaderingen gericht op het isoleren en perfuseren van het muizenhart zijn beschreven vóór24,25.

De methodologieën die worden gebruikt voor het verkrijgen van gegevens met betrekking tot enzymatische snelheden in het kloppende hart (met behulp van 13 C-spectroscopie en hyperpolarisatie [1-13C] pyruvaat) en de levensvatbaarheid en zuurgraad van het hart (met behulp van 31P NMR-spectroscopie) worden ook beschreven. Ten slotte worden de analysemethoden voor het bepalen van metabole enzymactiviteiten en de levensvatbaarheid en zuurgraad van weefsel uitgelegd.

Protocol

De gezamenlijke ethische commissie (IACUC) van de Hebreeuwse Universiteit en het Hadassah Medical Center keurden het studieprotocol voor dierenwelzijn goed (MD-19-15827-1). 1. Krebs-Henseleit buffervoorbereiding Maak een dag voor het experiment een aangepaste versie van de Krebs-Henseleit-buffer (KHB)26. Los in eerste instantie 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM pyruvaat, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 en 1,2 mM KH 2 PO4 op in …

Representative Results

De 31P-spectra die zijn geregistreerd van een muizenhart doordrenkt met KHB en van de buffer alleen zijn weergegeven in figuur 1A. De signalen van α-, β- en γ-ATP, PCr en Pi werden waargenomen in het hart. Het Pi-signaal bestond uit twee hoofdcomponenten: in het hogere veld (linkerkant van het signaal) was het Pi-signaal vooral te wijten aan de KHB bij een pH van 7,4; in het onderste veld (rechterkant van het signaal) was het Pi-signaal breder en minder homogeen door de zuurder…

Discussion

We demonstreren een experimentele opstelling die is ontworpen om hyperpolarized [1-13C] pyruvaatmetabolisme, weefsel-energetica en pH te onderzoeken in een geïsoleerd muizenhartmodel.

De kritieke stappen binnen het protocol zijn als volgt: 1) ervoor zorgen dat de pH van de buffer 7,4 is; 2) ervoor zorgen dat alle componenten van de buffer worden opgenomen; 3) het vermijden van bloedstolling in de hartvaten door heparine-injecties; 4) het vermijden van ischemische schade aan het har…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit project ontving financiering van de Israel Science Foundation onder subsidieovereenkomst nr. 1379/18; de Jabotinsky-beurs van het Israëlische ministerie van Wetenschap en Technologie voor toegepaste en technische wetenschappen voor directe promovendi nr. 3-15892 voor DS; en het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie onder subsidieovereenkomst nr. 858149 (AlternativesToGd).

Materials

Equipment
HyperSense DNP Polariser Oxford Instruments 52-ZNP91000 HyperSense, 3.35 T, preclinical dissolution-DNP hyperpolarizer
NMR spectrometer  RS2D NMR Cube, 5.8 T, equiped with a 10 mm broad-band probe
Peristaltic pump  Cole-Parmer 07554-95
Temperature probe Osensa FTX-100-LUX+ NMR compatible temprature probe
Somnosuite low-flow anesthesia system Kent Scientific
Lines, tubings, suture
Platinum cured silicone tubes Cole-Parmer HV-96119-16 L/S 16 I.D. 3.1 mm 
Thin polyether ether ketone (PEEK) lines Upchurch Scientific id. 0.040”
Intravenous catheter  BD Medical 381323 22 G
Silk suture Ethicon W577H Wire diameter of 3-0
Chemicals and pharmaceuticals
[1-13C]pyruvic acid Cambridge Isotope Laboratories CLM-8077-1
Calcium chloride Sigma-Aldrich 21074 CAS: 10043-52-4
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528 CAS: 50-99-77
Heparin sodium Rotexmedica HEP5A0130C0160
Hydrochloric acid 37% Sigma-Aldrich 258148 CAS: 7647-01-0
Insulin aspart (NovoLog) Novo Nordisk
Isoflurane Terrel
Magnesium Sulfate Sigma-Aldrich 793612 CAS: 7487-88-9
Potassium chloride Sigma-Aldrich P4504 CAS: 7447-40-7
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P9791 CAS: 7778-77-0
Sodium bicarbonate Gadot Group CAS: 144-55-8
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9625 CAS: 7647-14-5
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 655104 CAS: 1310-73-2
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907 CAS: 7558-79-4
Sodium phosphate monbasic dihydrate Merck 6345 CAS: 13472-35-0
TRIS (biotechnology grade) Amresco 0826 CAS: 77-86-1
Trityl radical OX063 GE Healthcare AS NC100136 OX063
NMR standards
13C standard sample Cambridge Isotope Laboratories DLM-72A 40% p-dioxane in benzene-D6
31P standard sample Made in house 105 mM ATP and 120 mM phenylphosphonic acid in D2O
Software
Excel 2016 Microsoft
MNova Mestrelab Research
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aquaro, G. D., Menichetti, L. Hyperpolarized 13C-magnetic resonance spectroscopy: Are we ready for metabolic imaging. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (6), 854-856 (2014).
  2. Schroeder, M. A., et al. Real-time assessment of Krebs cycle metabolism using hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy. FASEB Journal. 23 (8), 2529-2538 (2009).
  3. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of > 10,000 times in liquid-state NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  4. Merritt, M. E., et al. Hyperpolarized C-13 allows a direct measure of flux through a single enzyme-catalyzed step by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (50), 19773-19777 (2007).
  5. Ball, D. R., et al. Hyperpolarized butyrate: A metabolic probe of short chain fatty acid metabolism in the heart. Magn Reson Med. (5), 1663-1669 (2014).
  6. Khemtong, C., Carpenter, N. R., Lumata, L. L., et al. Hyperpolarized 13C NMR detects rapid drug-induced changes in cardiac metabolism. Magnetic Resonance in Medicine. 74 (2), 312-319 (2015).
  7. Mariotti, E., et al. Modeling non-linear kinetics of hyperpolarized [1-13C] pyruvate in the crystalloid-perfused rat heart. NMR in Biomedicine. 29 (4), 377-386 (2016).
  8. Moreno, K. X., Sabelhaus, S. M., Merritt, M. E., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Competition of pyruvate with physiological substrates for oxidation by the heart: implications for studies with hyperpolarized [1-13C]pyruvate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 298 (5), H1556-H1564 (2010).
  9. Purmal, C., et al. Propionate stimulates pyruvate oxidation in the presence of acetate. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 307 (8), H1134-H1141 (2014).
  10. Weiss, K., et al. Developing hyperpolarized 13C spectroscopy and imaging for metabolic studies in the isolated perfused rat heart. Applied Magnetic Resonance. 43 (1), 275-288 (2012).
  11. Merritt, M. E., Harrison, C., Storey, C., Sherry, A. D., Malloy, C. R. Inhibition of carbohydrate oxidation during the first minute of reperfusion after brief ischemia: NMR detection of hyperpolarized 13CO2and H13CO3. Magnetic Resonance in Medicine. 60 (5), 1029-1036 (2008).
  12. Schroeder, M. A., et al. Measuring intracellular pH in the heart using hyperpolarized carbon dioxide and bicarbonate: a 13C and 31P magnetic resonance spectroscopy study. Cardiovascular Research. 86 (1), 82-91 (2010).
  13. Ball, D. R., et al. Metabolic imaging of acute and chronic infarction in the perfused rat heart using hyperpolarised [1-13C]pyruvate. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1441-1450 (2013).
  14. Atherton, H. J., et al. Role of PDH inhibition in the development of hypertrophy in the hyperthyroid rat heart: a combined magnetic resonance imaging and hyperpolarized magnetic resonance spectroscopy study. Circulation. 123 (22), 2552-2561 (2011).
  15. Harris, T., et al. Hyperpolarized product selective saturating-excitations for determination of changes in metabolic reaction rates in real-time. NMR in Biomedicine. 33 (2), e4189 (2020).
  16. Shaul, D., et al. Correlation between lactate dehydrogenase/pyruvate dehydrogenase activities ratio and tissue pH in the perfused mouse heart: A potential noninvasive indicator of cardiac pH provided by hyperpolarized magnetic resonance. NMR in Biomedicine. 34 (2), e4444 (2021).
  17. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), e0160605 (2016).
  18. Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
  19. Lateef, R., Al-Masri, A., Alyahya, A. Langendorff’s isolated perfused rat heart technique: A review. International Journal of Basic and Clinical Pharmacology. 4, 1314-1322 (2015).
  20. Cross, H. R., Radda, G. K., Clarke, K. The role of Na+/K+ ATPase activity during low-flow ischemia in preventing myocardial injury – A 31P, 23Na and 87Rb NMR spectroscopic study. Magnetic Resonance in Medicine. 34 (5), 673-685 (1995).
  21. Cross, H. R., Clarke, K., Opie, L. H., Radda, G. K. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 27 (7), 1369-1381 (1995).
  22. Clarke, K., O’Connor, A. J., Willis, R. J. Temporal relation between energy metabolism and myocardial function during ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology. 253 (2), H412-H421 (1987).
  23. Yabe, T., Mitsunami, K., Inubushi, T., Kinoshita, M. Quantitative measurements of cardiac phosphorus metabolites in coronary artery disease by 31P magnetic resonance spectroscopy. Circulation. 92 (1), 15-23 (1995).
  24. Bakrania, B., Granger, J. P., Harmancey, R. Methods for the determination of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. Journal of Visualized Experiments. (115), e54497 (2016).
  25. Cordeiro, B., Clements, R. Murine isolated heart model of myocardial stunning associated with cardioplegic arrest. Journal of Visualized Experiments. (102), e52433 (2015).
  26. Kolwicz, S. C., Tian, R. Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (42), e2069 (2010).
  27. Nakadate, Y., et al. Glycemia and the cardioprotective effects of insulin pre-conditioning in the isolated rat heart. Cardiovascular Diabetology. 16 (1), 43 (2017).
  28. Lauritzen, M. H., et al. Enhancing the C-13 bicarbonate signal in cardiac hyperpolarized 1-C-13 pyruvate MRS studies by infusion of glucose, insulin and potassium. NMR in Biomedicine. 26 (11), 1496-1500 (2013).
  29. Adler-Levy, Y., et al. In-cell determination of lactate dehydrogenase activity in a luminal breast cancer model – ex vivo investigation of excised xenograft tumor slices using dDNP hyperpolarized [1-13C]pyruvate. Sensors. 19 (9), 2089 (2019).
  30. Young, A. A., Barnes, H., Davison, D., Neubauer, S., Schneider, J. E. Fast left ventricular mass and volume assessment in mice with three-dimensional guide-point modeling. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 30 (3), 514-520 (2009).
  31. Bailey, I. A., Williams, S. R., Radda, G. K., Gadian, D. G. Activity of phosphorylase in total global ischaemia in the rat heart. A phosphorus-31 nuclear-magnetic-resonance study. Biochemical Journal. 196 (1), 171-178 (1981).
  32. Lutz, N. W., Le Fur, Y., Chiche, J., Pouyssegur, J., Cozzone, P. J. Quantitative in vivo characterization of intracellular and extracellular pH profiles in heterogeneous tumors: A novel method enabling multiparametric pH analysis. Cancer Research. 7 (15), 4616-4628 (2013).
  33. Harris, T., Gamliel, A., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Impurities of [1-13C]pyruvic acid and a method to minimize their signals for hyperpolarized pyruvate metabolism studies. Applied Magnetic Resonance. 49 (10), 1085-1098 (2018).
  34. Cunningham, C. H., et al. Hyperpolarized 13C metabolic MRI of the human heart initial experience. Circulation Research. 119 (11), 1177-1182 (2016).
  35. Kurhanewicz, J., et al. Hyperpolarized 13C MRI: Path to clinical translation in oncology. Neoplasia. 21 (1), 1-16 (2019).
  36. Miloushev, V. Z., et al. Metabolic imaging of the human brain with hyperpolarized 13C pyruvate demonstrates 13C lactate production in brain tumor patients. Cancer Research. 78 (14), 3755-3760 (2018).
  37. Park, I., et al. Development of methods and feasibility of using hyperpolarized carbon-13 imaging data for evaluating brain metabolism in patient studies. Magnetic Resonance in Medicine. 80 (3), 864-873 (2018).
  38. Grist, J. T., et al. Quantifying normal human brain metabolism using hyperpolarized [1-13C]pyruvate and magnetic resonance imaging. Neuroimage. 189, 171-179 (2019).
  39. Nelson, S. J., et al. Metabolic imaging of patients with prostate cancer using hyperpolarized [1-C]pyruvate. Science Translational Medicine. 5 (198), (2013).
  40. Stødkilde-Jørgensen, H., et al. Pilot study experiences with hyperpolarized [1-13C]pyruvate MRI in pancreatic cancer patients. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 961-963 (2019).
  41. Autry, A. W., et al. Measuring tumor metabolism in pediatric diffuse intrinsic pontine glioma using hyperpolarized carbon-13 MR metabolic imaging. Contrast Media and Molecular Imaging. 2018, 3215658 (2018).
  42. Chung, B. T., et al. First hyperpolarized [2-13C]pyruvate MR studies of human brain metabolism. Journal of Magnetic Resonance. 309, 106617 (2019).
  43. Rider, O. J., et al. Noninvasive in vivo assessment of cardiac metabolism in the healthy and diabetic human heart using hyperpolarized 13C MRI. Circulation Research. 126 (6), 725-736 (2020).

Tags

Hyperpolarized MRICardiac MetabolismIsolated Perfused Mouse HeartPyruvate Metabolism13C/31P NMR SpectroscopyKrebs-Henseleit BufferAerobic And Anaerobic MetabolismCardiac EnergeticsPHLactateInorganic PhosphatePerfusion SystemTemperature Control
check_url/63188?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shaul, D., Sapir, G., Lev-Cohain, N., Sosna, J., Gomori, J. M., Katz-Brull, R. Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (194), e63188, doi:10.3791/63188 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image