Tabakhornwurm als Insektenmodellsystem für präklinische Cannabinoid-Studien
Summary
Das vorliegende Protokoll enthält Anleitungsinformationen für die Verwendung des Tabakhornwurms Manduca sexta in der Cannabinoidforschung. Die hier beschriebene Methode umfasst alle notwendigen Vorräte und Protokolle zur Überwachung physiologischer und Verhaltensänderungen des Insektenmodells als Reaktion auf die Behandlung mit Cannabidiol (CBD).
Abstract
Mit zunehmender Aufmerksamkeit für Cannabinoide in der Medizin wurden mehrere Modellorganismen von Säugetieren verwendet, um ihre unbekannten pharmazeutischen Funktionen aufzuklären. In der Säugetierforschung bleiben jedoch viele Schwierigkeiten bestehen, die die Entwicklung von Nicht-Säugetier-Modellorganismen für die Cannabinoidforschung erfordern. Die Autoren schlagen den Tabakhornwurm Manduca sexta als neuartiges Insektenmodellsystem vor. Dieses Protokoll enthält Informationen zur Vorbereitung der künstlichen Diät mit unterschiedlichen Mengen an Cannabidiol (CBD), zur Einrichtung einer Anbauumgebung und zur Überwachung ihrer physiologischen und Verhaltensänderungen als Reaktion auf die CBD-Behandlung. Kurz gesagt, nach Erhalt der Hornwurmeier durften die Eier 1-3 Tage bei 25 ° C in einem 12:12-Hell-Dunkel-Zyklus schlüpfen, bevor sie zufällig in die Kontrolle verteilt wurden (Weizenkeim-basierte künstliche Diät; AD), Vehikel (AD + 0,1% mittelkettiges Triglyceridöl; MCT-Öl) und Behandlungsgruppen (AD + 0,1% MCT + 1 mM oder 2 mM CBD). Sobald das Medium vorbereitet war, wurden die Larven des 1. Stadiums einzeln mit einem Holzspieß in ein 50-ml-Reagenzglas gegeben, und dann wurde das Reagenzglas mit einem Käsetuch bedeckt. Die Messungen wurden in 2-Tage-Intervallen für physiologische und Verhaltensreaktionen auf die CBD-Verabreichung durchgeführt. Dieses einfache Kultivierungsverfahren ermöglicht es den Forschern, große Proben in einem bestimmten Experiment zu testen. Darüber hinaus ermöglichen die relativ kurzen Lebenszyklen den Forschern, die Auswirkungen von Cannabinoidbehandlungen über mehrere Generationen einer homogenen Population zu untersuchen, so dass Daten ein experimentelles Design in höheren Säugetiermodellorganismen unterstützen können.
Introduction
In den letzten Jahren konzentrierte sich die öffentliche Aufmerksamkeit auf Cannabinoide aufgrund ihres therapeutischen Potenzials, einschließlich der Behandlung von Epilepsie1, Parkinson-Krankheit2, Multipler Sklerose3 und verschiedenen Krebsarten4,5,6 mit Cannabidiol (CBD). Seit Cannabis im Agricultural Improvement Act von 2018, Public Law 115-334 (farm bill 2018), als landwirtschaftliche Ware legalisiert ist, haben Cannabis und seine Cannabinoid-Derivate in der Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie exponentiell zugenommen. Darüber hinaus wurden Isolate einzelner Cannabinoide und Cannabinoidmischungen in klinischer Qualität erfolgreich an menschlichen Probanden7, Zelllinien5,8 und verschiedenen Tiermodellsystemen getestet9,10.
Eine klinische Studie wäre ideal, um die Wirksamkeit und die Nebenwirkungen von Cannabinoiden auf eine bestimmte Krankheit zu validieren. Es gibt jedoch zahlreiche Herausforderungen in klinischen Studien, einschließlich ethischer/IRB-Zulassung, Rekrutierung und Bindung der Probanden11. Um diese Hürden zu überwinden, wurden verschiedene menschliche Zelllinien verwendet, da vom Menschen stammende Zelllinien kostengünstig und einfach zu handhaben sind, die ethischen Probleme umgehen können und konsistente und reproduzierbare Ergebnisse liefern, da die Zelllinien eine “reine Population von Zellen sind, die keine Kreuzkontamination anderer Zellen und Chemikalien aufweisen”12.
Alves et al. (2021)13 testeten CBD dosisabhängig in den Plazenta-Trophoblasten, spezialisierten Zellen der Plazenta, die eine wesentliche Rolle bei der Embryonenimplantation und interaktion mit der dezidualisierten mütterlichen Gebärmutter spielen14. Ihre Ergebnisse zeigten, dass CBD den Verlust der Zelllebensfähigkeit, die Störung der Zellzyklusprogression und die Apoptose-Induktion verursachte. Diese Beobachtungen zeigen die potenziellen negativen Auswirkungen des Cannabiskonsums durch schwangere Frauen13. Ebenso wurde eine Reihe von Zelllinien verwendet, um die pharmakologischen Wirkungen von CBD bei menschlichen Krankheiten, insbesondere verschiedenen Krebsarten, zu untersuchen. Die In-vitro-Studien zeigten erfolgreich krebshemmende Wirkungen in Bauchspeicheldrüsen-15-, Brust-8– und Darmkrebszellen16. Spezifische Zelllinien wie HeLa, HEK293 sind zwar weit verbreitet und einfach zu handhaben, aber anfällig für genetische und phänotypische Veränderungen aufgrund von Veränderungen ihrer Wachstumsbedingungen oder handhabung17.
In der Cannabisforschung wurden verschiedene Tiermodellsysteme, von Kleintieren wie Maus18, Meerschweinchen19 und Kaninchen19 bis hin zu großen Tieren wie Canine20, Ferkel21, Affe22, Pferd23, verwendet, um unbekannte therapeutische Wirkungen zu erforschen. Mäuse waren aufgrund ihrer anatomischen, physiologischen und genetischen Ähnlichkeit mit dem Menschen das am meisten bevorzugte Tiermodellsystem für die Cannabinoidforschung24. Am wichtigsten ist, dass Mäuse CB1/2-Rezeptoren in ihrem Nervensystem haben, die beim Menschen vorhanden sind. Sie haben auch einen kürzeren Lebenszyklus als menschliche Probanden, mit einfacherer Wartung und reichlich vorhandenen genetischen Ressourcen, wodurch es viel einfacher wird, die Auswirkungen von Cannabinoiden während eines gesamten Lebenszyklus zu überwachen. Das Säugetiersystem ist weit verbreitet und hat erfolgreich gezeigt, dass CBD Anfallsleiden1, posttraumatische Belastungsstörungen9, orale Geschwüre25 und demenzähnliche Symptome10 lindert. Das Mausmodell hat auch eine Studie zur sozialen Interaktion von Individuen innerhalb einer Gemeinschaft ermöglicht, die bei großen Tieren und Menschen äußerst schwierig ist26.
Trotz aller Vorteile des Tiermodellsystems ist es immer noch kostspielig und erfordert intensive Pflege bei der Verabreichung von Medikamenten und der Datenerhebung. Darüber hinaus wird die Verwendung von Mäusen in der Forschung aufgrund von Unreproduzierbarkeit und schlechter Rekapitulation menschlicher Bedingungen aufgrund von Einschränkungen im experimentellen Design und in der Strenge untersucht27.
Mit der steigenden Nachfrage nach medizinischen/präklinischen Studien zu Cannabinoiden wird ein Modellsystem für Nicht-Säugetiere benötigt. Wirbellose Modelle boten traditionell deutliche Vorteile gegenüber Wirbeltiermodellen. Zu den wesentlichen Vorteilen gehören die einfache und niedrige Kosten der Aufzucht vieler Exemplare und die Möglichkeit für Forscher, mehrere Generationen genetisch homogener Populationen zu überwachen28. Eine kürzlich durchgeführte Studie bewies, dass die Fruchtfliege , Drosophila melanogaster, ein wirksames Insektenmodellsystem ist, um pharmakologische Funktionen von Cannabinoiden bei der Modulation des Fressverhaltens zu untersuchen29. Unter den Insektenmodellsystemen konzentrierten sich die Autoren auf den Tabakhornwurm Manduca sexta, auch bekannt als Carolina-Sphinxmotte oder Falkenmotte, als neuartiges Insektenmodellsystem für die Cannabinoidforschung.
Manduca sexta gehört zur Familie der Schwärmer (Sphingidae). Das Insekt ist der häufigste Pflanzenschädling im Süden der Vereinigten Staaten, wo sie sich von Nachtschattengewächsen ernähren. Das Insektenmodell hat eine lange Geschichte in der Forschung in der Insektenphysiologie, Biochemie, Neurobiologie und Arzneimittelwechselwirkungsstudien. Das Forschungsportfolio von Manduca sexta umfasst einen Entwurf der Genomsequenz, der ein Verständnis wesentlicher zellulärer Prozesse auf molekularer Ebene ermöglicht30. Ein weiterer entscheidender Vorteil dieses Modellsystems ist seine Größe, die in den 18-25 Tagen der Larvenentwicklung mehr als 100 mm Länge und 10 g Gewicht erreicht. Die große Größe ermöglicht es den Forschern, morphologische und Verhaltensänderungen in Echtzeit als Reaktion auf die CBD-Behandlung einfach zu überwachen. Aufgrund der Größe wurden auch elektrophysiologische Reaktionen mit dem abdominalen Nervensystem untersucht, einschließlich Ganglien, die von den Larven ohne hochauflösende Mikroskopeinstellungen seziert wurden. Die einzigartige Funktion ermöglicht es den Forschern, akute und langfristige Reaktionen auf die verabreichten Cannabinoide leicht zu untersuchen.
Trotz dieser Vielseitigkeit wurde M. sexta erst vor kurzem auf seine Eignung als experimentelles Modell für Cannabis– und Cannabinoidstudien untersucht. Im Jahr 2019 verwendeten die Autoren das Insektenmodellsystem zum ersten Mal, um die Hypothese zu behandeln, dass Cannabis sich entwickelt hat, um Cannabidiol zu produzieren, um sich vor Insektenfressern zu schützen30,31. Das Ergebnis zeigte deutlich, dass die Pflanzen CBD als Nahrungsabschreckung nutzten und das Wachstum des Schädlingsinsekts M. sexta raupe hemmten sowie eine erhöhte Mortalität verursachten31. Die Studie zeigte auch die rettende Wirkung von CBD auf berauschte Ethanollarven und identifizierte den potenziellen Vehikeleffekt von Ethanol als Träger des CBD. Wie gezeigt, untersuchte das Insektenmodellsystem effektiv die therapeutischen Wirkungen von Cannabinoiden innerhalb von 3-4 Wochen mit weniger Arbeit und Kosten als andere Tiersysteme. Obwohl dem Insektenmodell Cannabinoidrezeptoren fehlen (d.h. keine CB1/2-Rezeptoren), bietet das Modellsystem ein wertvolles Werkzeug, um die pharmakologischen Rollen von Cannabinoiden auf cannabinoidrezeptorunabhängige Weise zu verstehen.
Die Autoren dieser Studie haben zuvor mit dem Tabakhornwurm als Modellsystem für die Cannabinoidforschung gearbeitet31. Nach sorgfältiger Abwägung der Vorteile und Risiken der Anwendung von M. sexta haben wir eine Methode zur Verfügung gestellt, die die richtige Pflege und Vorbereitung der Ernährung für präklinische Studien beinhaltet und Möglichkeiten für den zukünftigen präklinischen Laboreinsatz bietet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Fütterungsstudie zeigte, dass hohe Dosen von CBD (2 mM) das Wachstum des Insekts hemmten und die Mortalität erhöhten31. Das Insektenmodell zeigte auch eine Empfindlichkeit gegenüber Ethanol; CBD entgiftete jedoch effektiv die Ethanoltoxizität und erhöhte ihre Überlebensrate, ihren Nahrungskonsum und ihr Lebensmittelsuchverhalten auf ein ähnliches Niveau wie die Kontrollgruppe (Abbildung 3A,B)31. Das beschriebene Ins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom Institut für Cannabisforschung an der Colorado State University-Pueblo und dem Ministerium für Wissenschaft und IKT (2021-DD-UP-0379) sowie der Stadt Chuncheon (Hanfforschung und -entwicklung und Industrialisierung, 2020-2021) unterstützt.
Materials
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
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