Табачный роговой червь как модельная система насекомых для доклинических исследований каннабиноидов
Summary
Настоящий протокол содержит инструктивную информацию по использованию табачного рогатого червя Manduca sexta в исследованиях каннабиноидов. Метод, описанный здесь, включает в себя все необходимые материалы и протоколы для мониторинга физиологических и поведенческих изменений модели насекомых в ответ на лечение каннабидиолом (CBD).
Abstract
С повышенным вниманием к каннабиноидам в медицине, несколько модельных организмов млекопитающих были использованы для выяснения их неизвестных фармацевтических функций. Тем не менее, многие трудности остаются в исследованиях млекопитающих, что требует разработки модельных организмов, не относящихся к млекопитающим, для исследований каннабиноидов. Авторы предполагают, что табачный роговой червь Manduca sexta является новой модельной системой насекомых. Этот протокол предоставляет информацию о подготовке искусственной диеты с различным количеством каннабидиола (КБД), создании среды культивирования и мониторинге их физиологических и поведенческих изменений в ответ на лечение КБД. Короче говоря, после получения яиц рогового червя яйцам разрешалось вылупляться в течение 1-3 дней при 25 °C в цикле 12:12 свет-темнота, прежде чем они были случайным образом распределены в контроль (искусственная диета на основе зародышей пшеницы; AD), транспортное средство (AD + 0,1% среднецепочечного триглицеридного масла; MCT oil) и группы обработки (AD + 0,1% MCT + 1 мМ или 2 мМ CBD). После того, как среда была подготовлена, личинки 1-й звезды были индивидуально помещены в пробирку объемом 50 мл с помощью деревянной шампурной палочки, а затем пробирка была покрыта марлей. Измерения проводились через 2-дневные интервалы для физиологических и поведенческих реакций на введение КБД. Эта простая процедура культивирования позволяет исследователям тестировать большие образцы в данном эксперименте. Кроме того, относительно короткие жизненные циклы позволяют исследователям изучать влияние каннабиноидных методов лечения на несколько поколений однородной популяции, что позволяет получать данные для поддержки экспериментального проекта в более высоких модельных организмах млекопитающих.
Introduction
В последние годы внимание общественности было сосредоточено на каннабиноидах из-за их терапевтического потенциала, включая лечение эпилепсии1, болезни Паркинсона2, рассеянного склероза3 и различных форм рака4,5,6 с помощью каннабидиола (CBD). Поскольку каннабис легализован как сельскохозяйственный товар в Законе об улучшении сельского хозяйства 2018 года, Публичном законе 115-334 (Законопроект о фермах 2018 года), каннабис и его каннабиноидные производные в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности экспоненциально увеличились. Кроме того, клинические изоляты одиночных каннабиноидов и каннабиноидных смесей были успешно протестированы на людях7, клеточных линиях5,8 и различных модельных системах животных9,10.
Клиническое испытание было бы идеальным для подтверждения эффективности и неблагоприятного воздействия каннабиноидов на конкретное заболевание. Тем не менее, существует множество проблем в клинических испытаниях, включая этическое / IRB одобрение, набор и удержание субъектов11. Чтобы преодолеть эти препятствия, были использованы различные клеточные линии человека, потому что клеточные линии человеческого происхождения экономически эффективны, просты в обращении, могут обходить этические проблемы и обеспечивать последовательные и воспроизводимые результаты, поскольку клеточные линии представляют собой «чистую популяцию клеток, которые не имеют перекрестного загрязнения других клеток и химических веществ»12.
Alves et al. (2021)13 протестировали КБД дозозависимым образом в плацентарных трофобластах, которые являются специализированными клетками плаценты, играющими важную роль в имплантации эмбриона и взаимодействии с децидуализированной материнской маткой14. Их результаты показали, что КБД вызывает потерю жизнеспособности клеток, нарушение прогрессирования клеточного цикла и индукцию апоптоза. Эти наблюдения демонстрируют потенциальные негативные последствия употребления каннабиса беременными женщинами13. Аналогичным образом, ряд клеточных линий также использовался для изучения фармакологических эффектов КБД при заболеваниях человека, в частности, различных формах рака. Исследования in vitro успешно продемонстрировали противораковые эффекты в клетках рака поджелудочной железы15, молочной железы8 и колоректального рака16. Однако, будучи широко доступными и простыми в обращении, конкретные клеточные линии, такие как HeLa, HEK293, склонны к генетическим и фенотипическим изменениям из-за изменений в условиях их роста или обработки17.
В исследованиях каннабиса различные системы моделей животных, начиная от мелких животных, таких как мышь18, морская свинка19 и кролик19, до крупных животных, таких как собака20, поросенок21, обезьяна22, лошадь23, были использованы для изучения неизвестных терапевтических эффектов. Мыши были наиболее предпочтительной модельной системой на животных для исследований каннабиноидов из-за их анатомического, физиологического и генетического сходства с людьми24. Самое главное, что мыши имеют рецепторы CB1/2 в своей нервной системе, которые присутствуют у людей. Они также имеют более короткий жизненный цикл, чем люди, с более легким обслуживанием и обильными генетическими ресурсами, что значительно облегчает мониторинг воздействия каннабиноидов на протяжении всего жизненного цикла. Система млекопитающих широко используется и успешно продемонстрировала, что КБД снимает судорожные расстройства1, посттравматическое стрессовое расстройство9, язвы полости рта25 и симптомы, подобные деменции10. Мышиная модель также позволила изучить социальное взаимодействие людей в сообществе, что чрезвычайно сложно у крупных животных и людей26.
Несмотря на все преимущества системы моделирования животных, она по-прежнему является дорогостоящей и требует интенсивной терапии во время введения лекарств и сбора данных. Кроме того, существует тщательное изучение использования мышей в исследованиях из-за невоспроизводимости и плохой рекапитуляции человеческих условий из-за ограничений в экспериментальном дизайне и строгости27.
С ростом спроса на медицинские/доклинические исследования каннабиноидов необходима модельная система, не относящаяся к млекопитающим. Модели беспозвоночных традиционно давали отличительные преимущества по сравнению с моделями позвоночных. Значительные преимущества включают в себя простоту и низкую стоимость выращивания многих образцов и возможность исследователей контролировать несколько поколений генетически однородных популяций28. Недавнее исследование доказало, что плодовая муха, Drosophila melanogaster, является эффективной модельной системой насекомых для изучения фармакологических функций каннабиноидов в модуляции пищевого поведения29. Среди модельных систем насекомых авторы сосредоточились на табачном рогатом черве, Manduca sexta, также известном как каролинская сфинксовая моль или ястребиная моль, в качестве новой системы моделей насекомых для исследований каннабиноидов.
Manduca sexta принадлежит к семейству Sphingidae. Насекомое является наиболее распространенным вредителем растений на юге Соединенных Штатов, где они питаются солнцестоятельными растениями. Модель насекомых имеет долгую историю исследований в области физиологии насекомых, биохимии, нейробиологии и исследований лекарственного взаимодействия. Исследовательский портфель Manduca sexta включает в себя проект последовательности генома, позволяющий понять на молекулярном уровне основные клеточные процессы30. Еще одним важным преимуществом этой модельной системы является ее большой размер, достигающий более 100 мм в длину и 10 г в весе в течение 18-25 дней развития личинок. Большой размер позволяет исследователям легко отслеживать морфологические и поведенческие изменения в режиме реального времени в ответ на лечение КБД. Кроме того, из-за размера были исследованы электрофизиологические реакции с брюшной нервной системой, включая ганглии, рассеченные из личинок без настроек микроскопа высокого разрешения. Уникальная особенность позволяет исследователям легко исследовать острые и долгосрочные реакции на введенный каннабиноид (ы).
Несмотря на такую универсальность, M. sexta только недавно был исследован на предмет его пригодности в качестве экспериментальной модели для исследований каннабиса и каннабиноидов. В 2019 году авторы впервые использовали систему моделирования насекомых для рассмотрения гипотезы о том, что каннабис эволюционировал для производства каннабидиола, чтобы защитить себя от насекомых-травоядных30,31. Результат ясно показал, что растения эксплуатировали КБД в качестве средства сдерживания питания и ингибировали рост насекомого-вредителя M. sexta caterpillar, а также вызывали повышенную смертность31. Исследование также продемонстрировало спасительное воздействие КБД на интоксицированных личинок этанола, определив потенциальный эффект этанола в качестве носителя КБД. Как показано, модельная система насекомых эффективно исследовала терапевтические эффекты каннабиноидов в течение 3-4 недель с меньшими трудозатратами и затратами, чем другие системы животных. Хотя в модели насекомых отсутствуют каннабиноидные рецепторы (т.е. нет рецепторов CB1/2), модельная система предоставляет ценный инструмент для понимания фармакологических ролей каннабиноидов с помощью каннабиноидного рецептора.
Авторы этого исследования ранее работали с табачным роговым червем в качестве модельной системы для исследований каннабиноидов31. После тщательного рассмотрения преимуществ и рисков использования M. sexta мы предоставили метод, предполагающий надлежащий уход и подготовку диеты для доклинических испытаний, которые открывают возможности для будущего доклинического лабораторного использования.
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследование кормления показало, что высокие дозы КБД (2 мМ) ингибируют рост насекомого и увеличивают смертность31. Модель насекомых также показала чувствительность к этанолу; однако КБД эффективно детоксифицировал токсичность этанола, увеличивая их выживаемость, потребл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Институтом исследований каннабиса при Университете штата Колорадо-Пуэбло и Министерством науки и ИКТ (2021-DD-UP-0379), а также городом Чхунчхон (Hemp R&D and industrialization, 2020-2021).
Materials
| Analytic balance | Mettler Instrument Corp. | AE100S | |
| Cannabidiol isolate (>99.4%) | Lilu's Garden | ||
| Cheesecloth | VWR INTERNATIONAL | 470150-438 | |
| Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes | VWR | 89093-192 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof | Sigma-Aldrich | EX0276-1 | |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Insect rearing chamber | Darwin Chambers | INR034 | |
| Medium chain triglycerides (MCT) oil | Walmart | ||
| Motion detection software (Actimetrics) | Coulbourn Instruments | ||
| Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm) | VWR INTERNATIONAL | 688161 | |
| Tobacco hormworm artificial diet | Carolina Biological Supply Company | Item # 143908 | Ready-To-Use-Hornworm-Diet |
| Tobacco hormworm eggs | Carolina Biological Supply Company | Item # 143880 | Unit of 30-50 |
References
- Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
- Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
- Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
- Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
- Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
- Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
- Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
- de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
- Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
- Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
- Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
- . Trophoblast Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021)
- Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
- Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
- Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
- Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
- Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
- Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
- Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
- Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
- Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
- Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
- Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
- Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. . Insect Models for Biomedical Research. , 61-72 (1989).
- He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
- Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
- Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
- Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
- Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
- Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
- McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. Cannabinoid receptors in invertebrates. Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).
