वयस्क Zebrafish में तैरना धीरज और तैरना व्यवहार का आकलन
Summary
रीढ़ की हड्डी की चोट के बाद कार्यात्मक वसूली में सक्षम, वयस्क ज़ेबराफ़िश तंत्रिका उत्थान के जन्मजात तंत्र को स्पष्ट करने के लिए एक प्रमुख मॉडल प्रणाली है। यहां, हम रीढ़ की हड्डी के उत्थान के कार्यात्मक रीडआउट के रूप में तैरने धीरज और तैरने के व्यवहार का वर्णन करते हैं।
Abstract
उनकी प्रसिद्ध पुनर्योजी क्षमता के कारण, वयस्क ज़ेबराफ़िश जन्मजात रीढ़ की हड्डी के उत्थान के तंत्र से पूछताछ करने के लिए एक प्रमुख कशेरुक मॉडल हैं। अपनी रीढ़ की हड्डी के पूर्ण अभिकर्मक के बाद, ज़ेब्राफ़िश कटे हुए ऊतकों में ग्लियाल और अक्षीय पुलों का विस्तार करती है, घाव के समीपस्थ न्यूरॉन्स को पुनर्जीवित करती है, और चोट के 8 सप्ताह के भीतर अपनी तैरने की क्षमता को फिर से प्राप्त करती है। तैरने समारोह की वसूली इस प्रकार कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी की मरम्मत के लिए एक केंद्रीय रीडआउट है। यहां, हम एक संलग्न तैरने वाली सुरंग के अंदर ज़ेब्राफ़िश मोटर क्षमता को मापने के लिए व्यवहारिक assays के एक सेट का वर्णन करते हैं। इन तरीकों का लक्ष्य वयस्क ज़ेब्राफ़िश में तैरने के धीरज और तैरने के व्यवहार के मात्रात्मक माप प्रदान करना है। तैरने के धीरज के लिए, ज़ेब्राफ़िश को थकावट तक लगातार बढ़ते पानी के वर्तमान वेग के अधीन किया जाता है, और थकावट पर समय की सूचना दी जाती है। तैरने के व्यवहार के आकलन के लिए, ज़ेबराफ़िश को कम वर्तमान वेगों के अधीन किया जाता है और मछली के पृष्ठीय दृश्य के साथ तैरने वाले वीडियो पर कब्जा कर लिया जाता है। प्रतिशत गतिविधि, फट आवृत्ति, और पानी की धारा के खिलाफ बिताया गया समय तैरने के व्यवहार के मात्रात्मक रीडआउट प्रदान करते हैं। हमने चोट से पहले और रीढ़ की हड्डी के बाद जंगली-प्रकार के ज़ेब्राफ़िश में तैरने के धीरज और तैरने के व्यवहार को परिमाणित किया। हमने पाया कि जेब्राफ़िश रीढ़ की हड्डी के ट्रांससेक्शन के बाद तैरने का कार्य खो देता है और धीरे-धीरे चोट के बाद 2 से 6 सप्ताह के बीच उस क्षमता को फिर से हासिल करता है। इस अध्ययन में वर्णित विधियों को न्यूरोबिहेवियरल, मस्कुलोस्केलेटल, कंकाल की मांसपेशियों के पुनर्जनन और वयस्क ज़ेबराफ़िश में तंत्रिका पुनर्जनन अध्ययनों पर लागू किया जा सकता है।
Introduction
वयस्क ज़ेबराफ़िश का उपयोग न्यूरोमस्कुलर और मस्कुलोस्केलेटल विकास और रोग मॉडलिंग 1,2,3 के तंत्र की जांच करने के लिए किया जाता है। ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क, रीढ़ की हड्डी और कंकाल की मांसपेशियों सहित कई ऊतकों की कुशल, सहज मरम्मत करने में सक्षम हैं4,5,6,7। न्यूरोमस्कुलर ऊतकों और मॉडल रोगों को पुनर्जीवित करने की उल्लेखनीय क्षमता वयस्क ज़ेब्राफ़िश अनुसंधान 1,2,3 में एक बढ़ते वैज्ञानिक समुदाय को आकर्षित कर रही है। हालांकि, जबकि लोकोमोशन और तैरने के व्यवहार के assays उपलब्ध हैं और लार्वा zebrafish के लिए मानकीकृत हैं, वयस्क मछली 8,9,10,11 में अनुरूप प्रोटोकॉल विकसित करने की बढ़ती आवश्यकता है। इस अध्ययन का लक्ष्य वयस्क ज़ेब्राफ़िश में तैरने के धीरज और तैरने के व्यवहार को मापने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करना है। हम इन प्रोटोकॉल को रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन अनुसंधान के संदर्भ में प्रस्तुत करते हैं। हालांकि, यहां वर्णित व्यवहार प्रोटोकॉल तंत्रिका और मांसपेशियों के उत्थान, न्यूरोमस्कुलर और मस्कुलोस्केलेटल विकास के अध्ययन के साथ-साथ न्यूरोमस्कुलर और मस्कुलोस्केलेटल रोग मॉडलिंग के अध्ययन के लिए समान रूप से लागू होते हैं।
Zebrafish रिवर्स पक्षाघात पूर्ण रीढ़ की हड्डी transection के 8 सप्ताह के भीतर. खराब पुनर्योजी स्तनधारियों के विपरीत, ज़ेबराफ़िश प्रो-पुनर्योजी प्रतिरक्षा, न्यूरोनल और ग्लियल चोट प्रतिक्रियाओं को प्रदर्शित करता है जो कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी की मरम्मत के लिए आवश्यक हैं12,13,14। कार्यात्मक रीढ़ की हड्डी की मरम्मत का एक अंतिम रीडआउट चोट के बाद अपने कार्य को फिर से हासिल करने के लिए घाव वाले ऊतक की क्षमता है। कृन्तकों में कार्यात्मक उत्थान का आकलन करने के लिए मानकीकृत तरीकों के एक सूट में लोकोमोटर, मोटर, संवेदी और संवेदी मोटर परीक्षण 15,16,17 शामिल हैं। माउस रीढ़ की हड्डी की चोट में व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले परीक्षणों में लोकोमोटर बासो माउस स्केल (बीएमएस), फोरलिंब मोटर परीक्षण, स्पर्श संवेदी परीक्षण और ग्रिड वॉकिंग सेंसरीमोटर परीक्षण 15,17 शामिल हैं। स्तनधारी या लार्वा ज़ेब्राफ़िश सिस्टम के विपरीत, वयस्क ज़ेबराफ़िश में व्यवहार परीक्षण कम विकसित होते हैं, फिर भी ऊतक पुनर्जनन और रोग मॉडलिंग समुदायों की बढ़ती जरूरतों को समायोजित करने के लिए बहुत आवश्यक है।
पूर्ण रीढ़ की हड्डी transections चोट स्थल के लिए पूर्ण पक्षाघात caudal में परिणाम. चोट लगने के तुरंत बाद, लकवाग्रस्त जानवर कम सक्रिय होते हैं और जितना संभव हो उतना तैरने से बचते हैं। खोई हुई तैरने की क्षमता की भरपाई करने के लिए, लकवाग्रस्त जानवर अपने पेक्टोरल पंखों का अधिक उपयोग करके छोटे, लगातार फटने का प्रदर्शन करते हैं, जो घाव के लिए रोस्ट्रल झूठ बोलते हैं। इस प्रतिपूरक तैरने की रणनीति के परिणामस्वरूप तेजी से थकावट और कम तैरने की क्षमता होती है। जैसा कि ज़ेब्राफ़िश रीढ़ की हड्डी regenerates, जानवरों घाव के लिए एक चिकनी oscillatory तैराकी समारोह caudal हासिल करते हैं, तैराकी धीरज में वृद्धि और बेहतर तैराकी व्यवहार मापदंडों के लिए अनुमति देता है। यहां, हम कम वर्तमान वेगों पर पानी की वर्तमान गति बढ़ाने और तैरने के व्यवहार पर ज़ेबराफ़िश तैरने के धीरज को मापने के तरीकों का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
वयस्क ज़ेबराफ़िश मानव रोगों के मॉडलिंग और ऊतक पुनर्जनन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक लोकप्रिय कशेरुक प्रणाली है। CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन ने ज़ेब्राफ़िश में मॉडलिंग रोग के लिए रिवर्स आनुवंशिक अध्ययन म?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जानवरों की देखभाल के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय Zebrafish साझा संसाधन धन्यवाद. इस शोध को एनआईएच (R01 NS113915 से M.H.M. तक) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
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