성인 제브라 피쉬의 수영 지구력 및 수영 행동 평가
Summary
척수 손상 후 기능적 회복이 가능한 성인 제브라피쉬는 신경 재생의 선천적 메커니즘을 밝히는 최고의 모델 시스템입니다. 여기에서는 수영 지구력과 수영 행동 분석을 척수 재생의 기능적 판독으로 설명합니다.
Abstract
그들의 유명한 재생 능력으로 인해, 성인 제브라 피쉬는 선천적 인 척수 재생의 메커니즘을 조사하는 최고의 척추 동물 모델입니다. 척수의 완전한 횡단 후, 제브라 피쉬는 절단 된 조직을 가로 질러 신경교 및 축삭 다리를 확장하고, 병변에 근접한 뉴런을 재생하고, 부상 후 8 주 이내에 수영 능력을 회복시킵니다. 따라서 수영 기능의 회복은 기능적 척수 복구를위한 중앙 판독입니다. 여기에서는 밀폐 된 수영 터널 내부의 제브라 피쉬 모터 용량을 정량화하기위한 일련의 행동 분석을 설명합니다. 이 방법의 목표는 성인 제브라 피쉬에서 수영 지구력과 수영 행동에 대한 정량화 가능한 측정을 제공하는 것입니다. 수영 지구력을 위해, 제브라 피쉬는 고갈 될 때까지 지속적으로 증가하는 물 전류 속도를 겪게되며, 고갈시 시간이보고됩니다. 수영 행동 평가를 위해 제브라 피쉬는 낮은 전류 속도를 받으며 수영 비디오는 물고기의 등쪽 뷰로 캡처됩니다. 퍼센트 활동, 파열 빈도 및 수류에 대해 소요 된 시간은 수영 행동의 정량화 가능한 판독을 제공합니다. 우리는 부상 전과 척수 횡단 후 야생형 제브라 피쉬에서 수영 지구력과 수영 행동을 정량화했습니다. 우리는 제브라 피쉬가 척수 횡단 후 수영 기능을 잃고 부상 후 2 주에서 6 주 사이에 점차적으로 그 능력을 회복한다는 것을 발견했습니다. 이 연구에 설명 된 방법은 성인 제브라 피쉬의 신경 행동, 근골격계, 골격근 재생 및 신경 재생 연구에 적용될 수 있습니다.
Introduction
성인 제브라 피쉬는 신경 근육 및 근골격계 발달 및 질병 모델링의 메커니즘을 조사하는 데 탁월하게 사용됩니다1,2,3. 제브라피쉬는 뇌, 척수 및 골격근을 포함한 여러 조직을 효율적이고 자발적으로 복구할 수 있습니다4,5,6,7. 신경 근육 조직을 재생하고 질병을 모델링 할 수있는 놀라운 능력은 성인 제브라 피쉬 연구에 성장하는 과학 공동체를 끌어 들이고 있습니다1,2,3. 그러나 애벌레 제브라 피쉬에 대한 운동 및 수영 행동에 대한 분석이 가능하고 표준화되었지만 성인 물고기에서 유사한 프로토콜을 개발할 필요성이 커지고 있습니다8,9,10,11. 이 연구의 목표는 성인 제브라 피쉬에서 수영 지구력과 수영 행동을 정량화하는 프로토콜을 설명하는 것입니다. 우리는 척수 재생 연구의 맥락에서 이러한 프로토콜을 제시합니다. 그러나, 여기에 기술된 행동 프로토콜은 신경 및 근육 재생, 신경근 및 근골격계 발달, 뿐만 아니라 신경근 및 근골격계 질환 모델링의 연구에 동일하게 적용가능하다.
Zebrafish는 완전한 척수 횡단 후 8 주 이내에 역마비. 저조한 재생 포유류와는 달리, 제브라피쉬는 기능성 척수 복구에 필요한 재생 면역, 신경 및 신경교 손상 반응을 나타냅니다12,13,14. 기능적 척수 복구의 궁극적 인 판독은 병변 조직이 부상 후 기능을 회복 할 수있는 능력입니다. 설치류의 기능 재생을 평가하기위한 표준화 된 방법 모음에는 운동 모터, 모터, 감각 및 감각 운동 테스트15,16,17이 포함됩니다. 마우스 척수 손상에 널리 사용되는 테스트에는 운동 바소 마우스 스케일 (BMS), 앞다리 운동 테스트, 촉각 감각 테스트 및 그리드 보행 감각 운동 테스트15,17이 포함됩니다. 포유류 또는 유충 제브라 피쉬 시스템과 달리 성인 제브라 피쉬의 행동 테스트는 덜 발달되어 있지만 조직 재생 및 질병 모델링 커뮤니티의 증가하는 요구를 수용하는 데 많이 필요합니다.
완전한 척수 횡단 절제술은 부상 부위에 완전한 마비 인과를 초래합니다. 부상 직후, 마비 된 동물은 덜 활동적이며 가능한 한 수영을 피하십시오. 잃어버린 수영 능력을 보완하기 위해 마비 된 동물은 병변에 rostral에있는 가슴 지느러미를 과도하게 사용하여 짧고 빈번한 파열을 나타냅니다. 이 보상 수영 전략은 빠른 피로와 낮은 수영 능력을 초래합니다. 제브라피쉬 척수가 재생됨에 따라 동물들은 병변에 대한 부드러운 진동 수영 기능을 회복하여 수영 지구력을 높이고 수영 행동 매개 변수를 향상시킵니다. 여기에서는 제브라 피쉬 수영 내구성을 증가시키고 물 전류 속도를 높이고 낮은 전류 속도에서 수영 행동을 정량화하는 방법을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성인 제브라 피쉬는 인간의 질병을 모델링하고 조직 재생 메커니즘을 연구하는 데 인기있는 척추 동물 시스템입니다. CRISPR / Cas9 게놈 편집은 제브라 피쉬에서 질병을 모델링하기위한 역 유전 연구에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 성인 제브라 피쉬의 대규모 유전학은 성인 제브라 피쉬 조직을 고처리량 표현형으로 사용할 수 없다는 것을 포함하여 생물학적 및 기술적 과제로 인해 방해 받고 있습?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 동물 보호를위한 워싱턴 대학 Zebrafish 공유 자원에 감사드립니다. 이 연구는 NIH (R01 NS113915 ~ M.H.M.)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
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