成体ゼブラフィッシュの水泳持久力と水泳行動の評価
Summary
脊髄損傷後の機能回復が可能な成体ゼブラフィッシュは、神経再生の先天的なメカニズムを解明するための最高のモデルシステムです。ここでは、脊髄再生の機能的読み出しとしての水泳持久力および水泳行動アッセイについて説明する。
Abstract
彼らの有名な再生能力のために、成体のゼブラフィッシュは先天的な脊髄再生のメカニズムを調査するための最高の脊椎動物モデルです。脊髄の完全な切断に続いて、ゼブラフィッシュは切断された組織を横切ってグリアおよび軸索ブリッジを延長し、病変の近位にあるニューロンを再生し、損傷から8週間以内に泳ぐ能力を取り戻す。したがって、水泳機能の回復は、機能的な脊髄修復のための中心的な読み出しである。ここでは、密閉された水泳トンネル内のゼブラフィッシュモーター容量を定量化するための一連の行動アッセイについて説明します。これらの方法の目的は、成体ゼブラフィッシュの水泳持久力および水泳行動の定量化可能な測定値を提供することである。水泳持久力のために、ゼブラフィッシュは枯渇するまで絶えず増加する水流速度にさらされ、そして枯渇時の時間が報告される。水泳行動評価のために、ゼブラフィッシュは低電流速度にさらされ、水泳ビデオは魚の背側ビューでキャプチャされます。活動率、バースト頻度、および水流に対して費やされた時間は、水泳行動の定量化可能な読み出しを提供します。野生型ゼブラフィッシュの遊泳持久力と泳ぎ行動を、傷害前および脊髄切除後に定量化した。ゼブラフィッシュは脊髄切除後に泳ぎ機能を失い、損傷後2〜6週間で徐々にその能力を取り戻すことがわかりました。この研究で説明した方法は、成体ゼブラフィッシュの神経行動学的、筋骨格的、骨格筋再生、および神経再生研究に適用することができる。
Introduction
成体のゼブラフィッシュは、神経筋および筋骨格系の発達および疾患モデリングのメカニズムを調査するために顕著に使用されている1,2,3。ゼブラフィッシュは、脳、脊髄、骨格筋を含む複数の組織の効率的で自発的な修復が可能です4,5,6,7。神経筋組織を再生し、疾患をモデル化する驚くべき能力は、成長する科学コミュニティを成体のゼブラフィッシュ研究に引き付けています1,2,3。しかし、幼虫のゼブラフィッシュには移動行動と泳ぎ行動のアッセイが利用可能で標準化されていますが、成魚では同様のプロトコルを開発する必要性が高まっています8,9,10,11。この研究の目的は、成体のゼブラフィッシュの水泳持久力と水泳行動を定量化するためのプロトコルを記述することです。我々は、脊髄再生研究の文脈でこれらのプロトコルを提示する。しかし、ここで説明する行動プロトコルは、神経および筋肉の再生、神経筋および筋骨格の発達、ならびに神経筋および筋骨格疾患のモデリングの研究にも同様に適用可能である。
ゼブラフィッシュは、完全な脊髄切断の8週間以内に逆麻痺する。再生不良の哺乳類とは異なり、ゼブラフィッシュは機能的な脊髄修復に必要な再生促進免疫、ニューロン、グリア損傷応答を示す12,13,14。機能的な脊髄修復の究極の読み出しは、損傷後に病変組織がその機能を回復する能力である。げっ歯類の機能再生を評価するための一連の標準化された方法には、自発運動、運動、感覚、および感覚運動試験が含まれる15,16,17。マウス脊髄損傷において広く用いられている試験には、自発運動バッソマウススケール(BMS)、前肢運動試験、触覚官能試験、および格子歩行感覚運動試験が含まれる15,17。哺乳類または幼虫のゼブラフィッシュ系とは対照的に、成体のゼブラフィッシュの行動テストはあまり発達していませんが、組織再生および疾患モデリングコミュニティの増大するニーズに対応するために大いに必要とされています。
完全な脊髄切除は、損傷部位への尾部の完全な麻痺をもたらす。怪我の直後に、麻痺した動物はあまり活発ではなく、できるだけ泳ぐのを避けます。失われた泳ぎ能力を補うために、麻痺した動物は、病変に吻側にある胸びれを過剰に使用することによって、短くて頻繁なバーストを示す。この代償的な水泳戦略は、急速な疲労と低い水泳能力をもたらします。ゼブラフィッシュ脊髄が再生するにつれて、動物は病変の尾部の滑らかな振動泳ぎ機能を取り戻し、水泳持久力の増加と水泳行動パラメータの改善を可能にします。ここでは、水流速度の上昇時のゼブラフィッシュの泳ぎ持久力と低電流速度での泳ぎ行動を定量化する方法について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
成体ゼブラフィッシュは、ヒトの疾患をモデル化し、組織再生のメカニズムを研究するための一般的な脊椎動物システムである。CRISPR/Cas9ゲノム編集は、ゼブラフィッシュの疾患をモデル化するための逆遺伝学的研究に革命をもたらしました。しかし、成体ゼブラフィッシュにおける大規模な遺伝学は、成体ゼブラフィッシュ組織がハイスループット表現型に利用できないことを含む、生物?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、動物の世話のためにワシントン大学ゼブラフィッシュ共有リソースに感謝します。この研究はNIH(R01 NS113915からM.H..M)の支援を受けた。
Materials
| AutoSwim software | Loligo Systems | MI10000 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Customized lid | Loligo Systems | MI10001 | This customized lid is used for swim endurance |
| DAQ-BT | Loligo Systems | SW10600 | Optional – for Automatic control of current velocity |
| Eheim pump | Loligo Systems | PU10160 | 20 L/min. This pump is placed in theflow-through tank. |
| Fiji | Fiji | Freely available through Image J (Fiji) | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Flowtherm | Loligo Systems | AC10000 | Handheld digital flow meter – for calibration |
| High Speed Camera | Loligo Systems | VE10380 | USB 3.0 color video camera (4MP) |
| IR light panel | Loligo Systems | VE10775 | 450 x 210 mm, placed under the swim tunnel chamber |
| Monofocal lens | Loligo Systems | VE10388 | 25mm manual lens |
| PVC Tubing | VWR | 60985-534 | 5/16 x 7/16" Wall thickness: 1/16" |
| R Studio | R Studio | Freely available. Version 3.6 with extra packages. | Specific script available at https://github.com/MokalledLab/SwimBehavior |
| Swim tunnel respirometer | Loligo Systems | SW10060 | 5L (120V/60Hz). The system includes the swim chamber, motor, manual control of water current velocity, 1 pump placed inside the chamber, standard swim tunnel lid for swim behavior, and modified swim tunnel lid for calibration |
| uEye Cockpit | IDS | Freely available software to control camera parameters | Alternative cameras and accompanying softwares could be used |
| Vane wheel flow probe | Loligo Systems | AC10002 | Digital flow probe – for calibration |
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