فحص كيميائي محسن للتعرف السريع على الجاذبات الكيميائية الريزوبكتيرية في إفرازات الجذر
Summary
هنا ، نقدم بروتوكول فحص كيميائي محسن. الهدف من هذا البروتوكول هو تقليل خطوات وتكاليف طرق التاكسي الكيميائي البكتيرية التقليدية والعمل كمورد قيم لفهم التفاعلات بين النبات والميكروبات.
Abstract
تحديد التاكسي الكيميائي مهم جدا للبحث وتطبيق البكتيريا المعززة لنمو الريزوسفير. أنشأنا طريقة مباشرة لتحديد الجاذبات الكيميائية بسرعة والتي يمكن أن تحفز الحركة الكيميائية للبكتيريا المعززة لنمو الريزوسفير على شرائح زجاجية معقمة عبر خطوات بسيطة. تمت إضافة محلول البكتيريا (OD600 = 0.5) والمحلول المائي الجاذب الكيميائي المعقم قطرة على الشريحة الزجاجية بفاصل زمني قدره 1 سم. تم استخدام حلقة تلقيح لتوصيل المحلول المائي الجاذب الكيميائي بالمحلول البكتيري. تم الاحتفاظ بالشريحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة على المقعد النظيف. وأخيرا ، تم جمع المحلول المائي الجاذب الكيميائي للعد البكتيري والمراقبة المجهرية. في هذه الدراسة ، من خلال مقارنات متعددة للنتائج التجريبية ، تغلبت الطريقة على أوجه قصور متعددة في طرق التاكسي الكيميائي البكتيرية التقليدية. قللت الطريقة من خطأ عد اللوحات وقصرت الدورة التجريبية. لتحديد المواد الجاذبة للكيماويات ، يمكن لهذه الطريقة الجديدة توفير 2-3 أيام مقارنة بالطريقة التقليدية. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح هذه الطريقة لأي باحث بإكمال تجربة التاكسي الكيميائي البكتيري بشكل منهجي في غضون 1-2 أيام. يمكن اعتبار البروتوكول موردا قيما لفهم التفاعلات بين النبات والميكروبات.
Introduction
يعتبر التاكسي الكيميائي مهما لاستعمار البكتيريا الجذرية المعززة لنمو النبات (PGPR) على الجذور ولفهم التفاعلات بين النبات والميكروبات1. تحفز فئة من المركبات منخفضة الوزن الجزيئي (الجاذبات الكيميائية) في إفرازات جذور النباتات الحركة الكيميائية ل PGPR إلى الريزوسفير2. حمض الماليك وحمض الستريك والمكونات الأخرى في إفرازات الجذر تحفز التاكسي الكيميائي لسلالات العصوية3. على سبيل المثال، الجلوكوز وحامض الستريك وحمض الفوماريك في إفرازات جذور الذرة تجند البكتيريا إلى سطح الجذر4. D-galactose ، المشتق من إفرازات الجذر ، يحفز التاكسي الكيميائي ل Bacillus velezensis SQR95. تؤثر الأحماض العضوية ، بما في ذلك الفومارات وحمض الماليك والسكسينات ، على التاكسي الكيميائي واستعمار مختلف PGPR في كاجانوس كاجان – Zea mays نظام المحاصيل البينية 6. حمض الأوليانوليك في إفرازات جذر الأرز ، يعمل كعامل جذب كيميائي للسلالة FP357. يمكن أن تلعب الإفرازات النباتية الأخرى (بما في ذلك الهيستيدين والأرجينين والأسبارتات) دورا حاسما في الاستجابة الكيميائية للبكتيريا8. تعمل إفرازات النبات كإشارة لتوجيه حركة البكتيريا ، وهي الخطوة الأولى أثناء استعمار الريزوسفير. استعمار النبات بواسطة PGPR هو عملية ذات أهمية هائلة ، حيث أن PGPR مفيد لمضيف النبات.
تم استخدام العديد من الطرق لتحليل التاكسي الكيميائي البكتيري. طريقة لوحة السباحة هي واحدة من الطرق الموضحة سابقا9. في هذه الطريقة ، تم تصنيع الألواح بوسط شبه صلب. تمت إضافة مخزن مؤقت كيميائي يحتوي على أجار (1.0٪ ، ث / v) إلى اللوحة. يتم تسخين المخزن المؤقت ، ثم يتم خلطه مع الجاذب الكيميائي. ثم ، تمت إضافة 8 ميكرولتر من تعليق البكتيريا إلى منتصف اللوحة وتم وضع اللوحة في حاضنة عند 28 درجة مئوية. تمت ملاحظة اللوحة وتصويرها بانتظام. ومع ذلك ، كانت الدورة التجريبية لطريقة لوحة السباحة طويلة جدا. في الطريقة الشبيهة بالشعيرات الدموية10 ، يعمل طرف الماصة كغرفة لحمل 100 ميكرولتر من التعليق البكتيري. تم استخدام إبرة حقنة 1 مل كشعيرات دموية. تم إدخال إبرة حقنة تحتوي على جاذبات كيميائية ذات تدرجات تركيز مختلفة في طرف ماصة 100 ميكرولتر. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات ، تمت إزالة إبرة المحقنة ، وتم تخفيف المحتوى وطلائه على الوسط. تم تمثيل التراكم البكتيري في المحقنة بوحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) في اللوحات. ومع ذلك ، كان الخطأ التجريبي داخل النسخ المتماثلة للطريقة الشبيهة بالشعيرات الدموية كبيرا. استخدمت طريقة أخرى جهاز SlipChip ميكروفلويديك 11. باختصار ، تم حقن محلول ألبومين مصل البقر (BSA) في جميع القنوات وإزالته باستخدام فراغ. تمت إضافة المحاليل التي تحتوي على جاذبات كيميائية مختلفة (تركيز 1 mM للكشف النوعي فقط) ، والخلايا البكتيرية المعلقة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات ومخزن ملحي مخزن بالفوسفات (التحكم السلبي) إلى الآبار الدقيقة العلوية والوسطى والسفلية ، على التوالي. ثم تم إجراء الحضانة في بيئة مظلمة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم تم الكشف عن الخلايا البكتيرية في الآبار الصغيرة. ومع ذلك ، كان جهاز SlipChip الموائع الدقيقة باهظ الثمن. لذلك ، كان لكل طريقة من الطرق الموضحة أعلاه مزايا وعيوب.
أنشأنا مقايسة كيميائية محسنة للتعرف السريع على الجاذبات الكيميائية الريزوبكتيرية في إفرازات الجذر باستخدام شرائح زجاجية معقمة دون خطوات معقدة. في هذه الدراسة ، من خلال مقارنات متعددة للنتائج التجريبية ، تغلبت الطريقة على أوجه قصور متعددة في طرق التاكسي الكيميائي البكتيرية التقليدية. قللت الطريقة من خطأ عد اللوحات وقصرت الدورة التجريبية. لذلك ، إذا تم استخدامها لتحديد مادة جاذبة كيميائيا ، فإن هذه الطريقة الجديدة يمكن أن توفر 2-3 أيام وتقلل من تكلفة المواد التجريبية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشير الأبحاث المتزايدة إلى أن التفاعلات بين النبات والبكتيريا تحدث بشكل رئيسي في الريزوسفير وتتأثر بإفرازات الجذر20،21،22،23،24. تشمل إفرازات جذور النباتات مجموعة متنوعة من الأيضات الأولية ، بما في ذلك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31870493) ، ومشاريع البحث والتطوير الرئيسية في هيلونغجيانغ ، الصين (GA21B007) ، ورسوم البحوث الأساسية للجامعات في مقاطعة هيلونغجيانغ ، الصين (رقم 135409103).
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
References
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).
- Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. Root exudates mediated interactions belowground. Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).
- Zhang, N., et al. Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains. Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).
- Zhang, N., et al. Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates. BMC Genomics. 16 (1), 685 (2015).
- Lui, Y., et al. Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).
- Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan – Zea mays intercropping system. Rhizosphere. 18 (12), 100331 (2021).
- Sampedro, I., et al. Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T. Microorganisms. 8 (4), 575 (2020).
- Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).
- Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere. European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Shen, C., et al. Bacterial chemotaxis on Slipchip. Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).
- Liu, H., et al. Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).
- Goswami, M., Deka, S. Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens. Microbiological Research. 240, 126516 (2020).
- Kaiira, M., Chemining’Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize. Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).
- Shi, Y., et al. Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans. African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).
- Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice. Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).
- Belimov, A. A., et al. Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum). Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).
- Ankati, S., Podile, A. R. Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner. Journal of Plant Physiology. 243, 153057 (2019).
- Gordillo, F., Chavez, F., Jerez, C. A. Motility and chemotaxis of Pseudomonas sp. B4 towards polychlorobiphenyls and chlorobenzoates. FEMS Microbiology Ecology. 60 (2), 322-328 (2007).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions. Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).
- Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).
- Kamilova, F., et al. Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum. Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).
- Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates. Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).
