Un ensayo de quimiotaxis mejorado para la identificación rápida de quimioatrayentes rizobacterianos en exudados radiculares
Summary
Aquí, presentamos un protocolo mejorado de ensayo de quimiotaxis. El objetivo de este protocolo es reducir los pasos y los costos de los métodos tradicionales de quimiotaxis bacteriana y servir como un recurso valioso para comprender las interacciones planta-microbio.
Abstract
La identificación de quimiotaxis es muy importante para la investigación y aplicación de bacterias promotoras del crecimiento de la rizosfera. Establecimos un método sencillo para identificar rápidamente los quimioatrayentes que podrían inducir el movimiento quimiotáctico de las bacterias promotoras del crecimiento de la rizosfera en portaobjetos de vidrio estériles a través de pasos simples. La solución bacteriana (OD600 = 0,5) y la solución acuosa quimioatrayente estéril se agregaron gota a gota en el portaobjetos de vidrio a un intervalo de 1 cm. Se utilizó un asa inoculante para conectar la solución acuosa quimioatrayente a la solución bacteriana. El tobogán se mantuvo a temperatura ambiente durante 20 minutos en el banco limpio. Finalmente, se recogió la solución acuosa quimioatrayente para el recuento bacteriano y la observación microscópica. En este estudio, a través de múltiples comparaciones de resultados experimentales, el método superó múltiples deficiencias de los métodos tradicionales de quimiotaxis bacteriana. El método redujo el error de conteo de placas y acortó el ciclo experimental. Para la identificación de sustancias quimioatrayentes, este nuevo método puede ahorrar 2-3 días en comparación con el método tradicional. Además, este método permite a cualquier investigador completar sistemáticamente un experimento de quimiotaxis bacteriana en 1-2 días. El protocolo puede considerarse un recurso valioso para comprender las interacciones planta-microbio.
Introduction
La quimiotaxis es importante para la colonización de las rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (PGPR) en las raíces y para comprender las interacciones planta-microbio1. Una clase de compuestos de bajo peso molecular (quimioatrayentes) en los exudados de la raíz de las plantas inducen el movimiento quimiotáctico de PGPR a la rizosfera2. El ácido málico, el ácido cítrico y otros componentes de los exudados radiculares estimulan la quimiotaxis de las cepas de Bacillus3. Por ejemplo, la glucosa, el ácido cítrico y el ácido fumárico en los exudados de la raíz del maíz reclutan bacterias a la superficie de la raíz4. La D-galactosa, que se deriva de los exudados radiculares, induce la quimiotaxis de Bacillus velezensis SQR95. Los ácidos orgánicos, incluyendo fumarato, ácido málico y succinato, influyen en la quimiotaxis y la colonización de varios PGPR en el sistema de cultivo intercalado Cajanus cajan – Zea mays6. El ácido oleanólico en los exudados de la raíz de arroz, actúa como quimioatrayente para la cepa FP357. Otros exudados vegetales (incluyendo histidina, arginina y aspartato) pueden desempeñar un papel crucial en la respuesta quimiotáctica de las bacterias8. Los exudados de las plantas funcionan como una señal para dirigir el movimiento de las bacterias, que es el primer paso durante la colonización de la rizosfera. La colonización de plantas por PGPR es un proceso de enorme relevancia, ya que los PGPR son beneficiosos para el huésped de la planta.
Se han utilizado muchos métodos para analizar la quimiotaxis bacteriana. El método de la placa de natación es uno de los métodos descritos anteriormente9. En este método, las placas se hicieron con un medio semisólido. Se agregó un tampón quimiotáctico que contenía agar (1.0%, p/v) a la placa. El tampón se calienta y luego se mezcla con el quimioatrayente. Luego, se agregaron 8 μL de suspensión de bacterias gota a gota a la mitad de la placa y la placa se colocó en una incubadora a 28 ° C. La placa fue observada y fotografiada regularmente. Sin embargo, el ciclo experimental del método de la placa de natación fue muy largo. En el método capilar10, una punta de pipeta sirve como cámara para contener 100 μL de suspensión bacteriana. Se utilizó una aguja de jeringa de 1 ml como capilar. Se insertó una aguja de jeringa que contenía quimioatrayentes con diferentes gradientes de concentración en la punta de la pipeta de 100 μL. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 3 h, se retiró la aguja de la jeringa, el contenido se diluyó y se enchapó en el medio. La acumulación bacteriana en la jeringa estaba representada por unidades formadoras de colonias (UFC) en las placas. Sin embargo, el error experimental dentro de las réplicas para el método capilar fue grande. Otro método utilizó un dispositivo Microfluídico SlipChip11. Brevemente, la solución de albúmina sérica bovina (BSA) se inyectó en todos los canales y se retiró al vacío. Las soluciones que contenían diferentes quimioatrayentes (concentración de 1 mM solo para detección cualitativa), células bacterianas suspendidas en solución salina tamponada con fosfato y tampón salino tamponado con fosfato (control negativo) se agregaron a los micropocillos superior, medio e inferior, respectivamente. La incubación se realizó en un ambiente oscuro a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células bacterianas se detectaron en los micropocillos. El dispositivo microfluídico SlipChip, sin embargo, era caro. Por lo tanto, cada uno de los métodos descritos anteriormente tenía ventajas y desventajas.
Se estableció un ensayo de quimiotaxis mejorado para la identificación rápida de quimioatrayentes rizobacterianos en exudados radiculares utilizando portaobjetos de vidrio estériles sin pasos complicados. En este estudio, a través de múltiples comparaciones de resultados experimentales, el método superó múltiples deficiencias de los métodos tradicionales de quimiotaxis bacteriana. El método redujo el error de conteo de placas y acortó el ciclo experimental. Por lo tanto, si se utiliza para identificar una sustancia quimioatrayente, este nuevo método puede ahorrar 2-3 días y reducir el costo de los materiales experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aumento de la investigación indica que las interacciones planta-bacteria ocurren principalmente en la rizosfera y están influenciadas por los exudados de la raíz20,21,22,23,24. Los exudados de las raíces de las plantas incluyen una amplia gama de metabolitos primarios, incluidos ácidos fenólicos, ácidos orgánicos y aminoácidos, así como compuestos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 31870493), los Proyectos Clave de Investigación y Desarrollo en Heilongjiang, China (GA21B007) y las Tarifas de Investigación Básica de las Universidades en la Provincia de Heilongjiang, China (No. 135409103).
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
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