Ein verbesserter Chemotaxis-Assay zur schnellen Identifizierung von rhizobakteriellen Chemoattraktantien in Wurzelexsudaten
Summary
Hier präsentieren wir ein verbessertes Chemotaxis-Assay-Protokoll. Ziel dieses Protokolls ist es, die Schritte und Kosten herkömmlicher bakterieller Chemotaxis-Methoden zu reduzieren und als wertvolle Ressource für das Verständnis von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen zu dienen.
Abstract
Die Chemotaxis-Identifizierung ist sehr wichtig für die Erforschung und Anwendung von rhizosphärenwachstumsfördernden Bakterien. Wir haben eine einfache Methode etabliert, um schnell die Chemoattraktiva zu identifizieren, die die chemotaktische Bewegung von rhizosphärenwachstumsfördernden Bakterien auf sterilen Glasobjektträgern in einfachen Schritten induzieren könnten. Bakterienlösung (OD600 = 0,5) und sterile chemoattraktive wässrige Lösung wurden im Abstand von 1 cm tropfenweise auf den Glasobjektträger gegeben. Eine Impfschleife wurde verwendet, um die chemoattraktive wässrige Lösung mit der bakteriellen Lösung zu verbinden. Die Rutsche wurde bei Raumtemperatur für 20 min auf der sauberen Bank gehalten. Schließlich wurde die chemoattraktive wässrige Lösung für die Bakterienzählung und mikroskopische Beobachtung gesammelt. In dieser Studie überwand die Methode durch mehrfache Vergleiche experimenteller Ergebnisse mehrere Mängel herkömmlicher bakterieller Chemotaxis-Methoden. Die Methode reduzierte den Fehler der Plattenzählung und verkürzte den Versuchszyklus. Für die Identifizierung von chemoattraktiven Substanzen kann diese neue Methode im Vergleich zur herkömmlichen Methode 2-3 Tage einsparen. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode jedem Forscher, ein bakterielles Chemotaxis-Experiment innerhalb von 1-2 Tagen systematisch abzuschließen. Das Protokoll kann als wertvolle Ressource für das Verständnis von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen angesehen werden.
Introduction
Chemotaxis ist wichtig für die Besiedlung von pflanzenwachstumsfördernden Rhizobakterien (PGPR) auf Wurzeln und für das Verständnis von Pflanzen-Mikroben-Interaktionen1. Eine Klasse niedermolekularer Verbindungen (Chemoattraktiva) in Pflanzenwurzelexsudaten induziert die chemotaktische Bewegung von PGPR in die Rhizosphäre2. Apfelsäure, Zitronensäure und andere Komponenten in den Wurzelexsudaten stimulieren die Chemotaxis von Bacillus-Stämmen3. Zum Beispiel rekrutieren Glukose, Zitronensäure und Fumarsäure in Maiswurzelexsudaten Bakterien an die Wurzeloberfläche4. D-Galactose, die aus Wurzelexsudaten gewonnen wird, induziert die Chemotaxis von Bacillus velezensis SQR95. Organische Säuren, einschließlich Fumarat, Apfelsäure und Bernsteinat, beeinflussen die Chemotaxis und die Besiedlung verschiedener PGPR im Cajanus cajan – Zea mays Zwischenfruchtsystem6. Oleanolsäure in Reiswurzelexsudaten wirkt als Chemoattraktivum für den Stamm FP357. Andere pflanzliche Exsudate (einschließlich Histidin, Arginin und Aspartat) können eine entscheidende Rolle bei der chemotaktischen Reaktion von Bakterien spielen8. Pflanzenexsudate fungieren als Signal, um die Bewegung von Bakterien zu steuern, was der erste Schritt während der Rhizosphärenbesiedlung ist. Die Pflanzenbesiedlung durch PGPR ist ein Prozess von enormer Relevanz, da PGPR für den Pflanzenwirt von Vorteil sind.
Viele Methoden wurden zur Analyse der bakteriellen Chemotaxis verwendet. Die Schwimmplattenmethode ist eine der zuvor beschriebenen Methoden9. Bei diesem Verfahren wurden Platten mit einem halbfesten Medium hergestellt. Ein chemotaktischer Puffer, der Agar (1,0%, w/v) enthielt, wurde der Platte zugesetzt. Der Puffer wird erhitzt und dann mit dem Chemoattraktivum gemischt. Dann wurden 8 μL Bakteriensuspension tropfenweise in die Mitte der Platte gegeben und die Platte bei 28 °C in einen Inkubator gegeben. Die Platte wurde regelmäßig beobachtet und fotografiert. Der experimentelle Zyklus der Schwimmplattenmethode war jedoch sehr lang. Bei der kapillarartigen Methode10 dient eine Pipettenspitze als Kammer zur Aufnahme von 100 μL Bakteriensuspension. 1 ml Spritzennadel wurde als Kapillare verwendet. In die 100 μL Pipettenspitze wurde eine Spritzennadel mit Chemotraktoren mit unterschiedlichen Konzentrationsgradienten eingeführt. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur für 3 h wurde die Spritzennadel entfernt, der Inhalt verdünnt und auf dem Medium plattiert. Die bakterielle Akkumulation in der Spritze wurde durch koloniebildende Einheiten (CFUs) in den Platten dargestellt. Der experimentelle Fehler innerhalb von Replikaten für die kapillarartige Methode war jedoch groß. Eine andere Methode verwendete ein mikrofluidisches SlipChip-Gerät11. Kurz gesagt, Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung wurde in alle Kanäle injiziert und mit einem Vakuum entfernt. Die Lösungen, die verschiedene Chemoattraktiva (1 mM-Konzentration nur für den qualitativen Nachweis), Bakterienzellen, die in phosphatgepufferter Kochsalzlösung suspendiert sind, und phosphatgepufferter Kochsalzpuffer (Negativkontrolle) enthielten, wurden den oberen, mittleren bzw. unteren Mikrobohrlöchern zugesetzt. Die Inkubation wurde dann in einer dunklen Umgebung bei Raumtemperatur für 30 min durchgeführt. Die Bakterienzellen wurden dann in den Mikrotrüchtigen nachgewiesen. Das mikrofluidische SlipChip-Gerät war jedoch teuer. Daher hatte jede der oben beschriebenen Methoden Vor- und Nachteile.
Wir haben einen verbesserten Chemotaxis-Assay zur schnellen Identifizierung von rhizobakteriellen Chemoattraktiva in Wurzelexsudaten unter Verwendung steriler Glasobjektträger ohne komplizierte Schritte etabliert. In dieser Studie überwand die Methode durch mehrfache Vergleiche experimenteller Ergebnisse mehrere Mängel herkömmlicher bakterieller Chemotaxis-Methoden. Die Methode reduzierte den Fehler der Plattenzählung und verkürzte den Versuchszyklus. Wenn diese neue Methode zur Identifizierung einer chemoattraktiven Substanz verwendet wird, kann sie 2-3 Tage einsparen und die Kosten für experimentelle Materialien senken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zunehmende Forschungen deuten darauf hin, dass Pflanzen-Bakterien-Interaktionen hauptsächlich in der Rhizosphäre auftreten und durch Wurzelexsudate beeinflusst werden20,21,22,23,24. Pflanzenwurzelexsudate umfassen eine Vielzahl von Primärmetaboliten, darunter Phenolsäuren, organische Säuren und Aminosäuren sowie komplexere Sekundärverbindungen25,26,27.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 31870493), den Key Research and Development Projects in Heilongjiang, China (GA21B007), und den Basic Research Fees of Universities in Heilongjiang Province, China (No. 135409103) unterstützt.
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
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