Et forbedret kemotaxisassay til hurtig identifikation af rhizobakterielle kemotiltrapitter i rodexsudater
Summary
Her præsenterer vi en forbedret kemotaxis assayprotokol. Målet med denne protokol er at reducere trin og omkostninger ved traditionelle bakterielle kemotaxismetoder og at tjene som en værdifuld ressource til forståelse af plante-mikrobe-interaktioner.
Abstract
Kemotaxis identifikation er meget vigtig for forskning og anvendelse af rhizosfære vækstfremmende bakterier. Vi etablerede en ligetil metode til hurtigt at identificere de kemotiltrækkende stoffer, der kunne fremkalde den kemotaktiske bevægelse af rhizosfærens vækstfremmende bakterier på sterile glasrutschebaner via enkle trin. Bakterieopløsning (OD600 = 0,5) og steril kemotiltrtrukken vandig opløsning blev tilsat dråbevis på glasglideren med et interval på 1 cm. En podningssløjfe blev brugt til at forbinde den kemoattraherende vandige opløsning til bakterieopløsningen. Rutsjebanen blev holdt ved stuetemperatur i 20 minutter på den rene bænk. Endelig blev den kemotrerende vandige opløsning opsamlet til bakterietælling og mikroskopisk observation. I denne undersøgelse overvandt metoden gennem flere sammenligninger af eksperimentelle resultater flere mangler ved traditionelle bakterielle kemotaxismetoder. Metoden reducerede fejlen ved pladetælling og forkortede forsøgscyklussen. Til identifikation af kemotiltrækkende stoffer kan denne nye metode spare 2-3 dage i forhold til den traditionelle metode. Derudover giver denne metode enhver forsker mulighed for systematisk at gennemføre et bakterielt kemotaxiseksperiment inden for 1-2 dage. Protokollen kan betragtes som en værdifuld ressource til forståelse af interaktioner mellem planter og mikrober.
Introduction
Kemotaxis er vigtig for kolonisering af plantevækstfremmende rhizobakterielle (PGPR) på rødder og for forståelse af plante-mikrobe-interaktioner1. En klasse af lavmolekylære forbindelser (kemoattractants) i planterodekssudater inducerer PGPR’s kemotaktiske bevægelse til rhizosfæren2. Æblesyre, citronsyre og andre komponenter i rodekssudaterne stimulerer kemotaxis af Bacillus-stammer3. For eksempel rekrutterer glukose, citronsyre og fumarsyre i majsrodekssudater bakterier til rodoverfladen4. D-galactose, som er afledt af rodekssudater, inducerer kemotaxis af Bacillus velezensis SQR95. Organiske syrer, herunder fumarat, æblesyre og succinat, påvirker kemotaxis og kolonisering af forskellige PGPR i Cajanus cajan – Zea mays intercropping system6. Oleanolsyre i risrodsekssudater, virker som et kemotiltrækkemiddel for stammen FP357. Andre planteekssudater (herunder histidin, arginin og aspartat) kan spille en afgørende rolle i bakteriernes kemotaktiske respons8. Planteekssudater fungerer som et signal til at styre bevægelsen af bakterier, hvilket er det første skridt under rhizosfærekolonisering. Plantekolonisering af PGPR er en proces af enorm relevans, da PGPR er gavnlig for planteværten.
Mange metoder er blevet brugt til at analysere bakteriel kemotaxis. Svømmeplademetoden er en af de tidligere beskrevne metoder9. I denne metode blev plader fremstillet med et halvfast medium. En kemotaktisk buffer indeholdende agar (1,0%, w/v) blev tilsat pladen. Bufferen opvarmes og blandes derefter med kemoatettrivet. Derefter blev 8 μL bakteriesuspension tilsat dråbevis til midten af pladen, og pladen blev anbragt i en inkubator ved 28 °C. Pladen blev regelmæssigt observeret og fotograferet. Den eksperimentelle cyklus af svømmeplademetoden var imidlertid meget lang. I den kapillærlignende metode10 fungerer en pipettespids som et kammer til at holde 100 μL bakteriel suspension. 1 ml sprøjtenål blev brugt som kapillær. En sprøjtenål indeholdende kemotiltraptanter med forskellige koncentrationsgradienter blev indsat i 100 μL pipettespidsen. Efter inkubation ved stuetemperatur i 3 timer blev sprøjtenålen fjernet, indholdet blev fortyndet og belagt på mediet. Den bakterielle ophobning i sprøjten var repræsenteret af kolonidannende enheder (CFU’er) i pladerne. Den eksperimentelle fejl i replikater for den kapillærlignende metode var imidlertid stor. En anden metode anvendte en mikrofluidisk SlipChip-enhed11. Kort fortalt blev bovin serumalbumin (BSA) opløsning injiceret i alle kanaler og fjernet ved hjælp af et vakuum. Opløsningerne indeholdende forskellige kemoattrahtanter (1 mM koncentration kun til kvalitativ påvisning), bakterieceller suspenderet i fosfatbufret saltvand og fosfatbufret saltvandsbuffer (negativ kontrol) blev tilsat til henholdsvis de øverste, midterste og nederste mikrobrønde. Inkubation blev derefter udført i et mørkt miljø ved stuetemperatur i 30 minutter. Bakteriecellerne blev derefter påvist i mikrobrøndene. Den mikrofluidiske SlipChip-enhed var imidlertid dyr. Derfor havde hver af de ovenfor beskrevne metoder fordele og ulemper.
Vi etablerede et forbedret kemotaxis-assay til hurtig identifikation af rhizobakterielle kemotiltriva i rodexsudater ved hjælp af sterile glasrutschebaner uden komplicerede trin. I denne undersøgelse overvandt metoden gennem flere sammenligninger af eksperimentelle resultater flere mangler ved traditionelle bakterielle kemotaxismetoder. Metoden reducerede fejlen ved pladetælling og forkortede forsøgscyklussen. Derfor, hvis den bruges til at identificere et kemotiltrækkende stof, kan denne nye metode spare 2-3 dage og reducere omkostningerne ved eksperimentelle materialer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stigende forskning indikerer, at plante-bakterie-interaktioner hovedsageligt forekommer i rhizosfæren og påvirkes af rodesudater20,21,22,23,24. Planterodekssudater omfatter en bred vifte af primære metabolitter, herunder phenolsyrer, organiske syrer og aminosyrer samt mere komplekse sekundære forbindelser25,26,27.<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 31870493), de vigtigste forsknings- og udviklingsprojekter i Heilongjiang, Kina (GA21B007) og de grundlæggende forskningsgebyrer for universiteter i Heilongjiang-provinsen, Kina (nr. 135409103).
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
References
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).
- Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. Root exudates mediated interactions belowground. Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).
- Zhang, N., et al. Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains. Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).
- Zhang, N., et al. Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates. BMC Genomics. 16 (1), 685 (2015).
- Lui, Y., et al. Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).
- Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan – Zea mays intercropping system. Rhizosphere. 18 (12), 100331 (2021).
- Sampedro, I., et al. Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T. Microorganisms. 8 (4), 575 (2020).
- Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).
- Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere. European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Shen, C., et al. Bacterial chemotaxis on Slipchip. Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).
- Liu, H., et al. Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).
- Goswami, M., Deka, S. Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens. Microbiological Research. 240, 126516 (2020).
- Kaiira, M., Chemining’Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize. Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).
- Shi, Y., et al. Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans. African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).
- Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice. Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).
- Belimov, A. A., et al. Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum). Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).
- Ankati, S., Podile, A. R. Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner. Journal of Plant Physiology. 243, 153057 (2019).
- Gordillo, F., Chavez, F., Jerez, C. A. Motility and chemotaxis of Pseudomonas sp. B4 towards polychlorobiphenyls and chlorobenzoates. FEMS Microbiology Ecology. 60 (2), 322-328 (2007).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions. Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).
- Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).
- Kamilova, F., et al. Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum. Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).
- Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates. Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).
