En forbedret Chemotaxis-analyse for rask identifisering av rhizobakterielle kjemoattractanter i roteksudater
Summary
Her presenterer vi en forbedret chemotaxis analyseprotokoll. Målet med denne protokollen er å redusere trinnene og kostnadene ved tradisjonelle bakterielle chemotaxis-metoder og tjene som en verdifull ressurs for å forstå plantemikrobeinteraksjoner.
Abstract
Chemotaxis identifikasjon er svært viktig for forskning og anvendelse av rhizosphere vekstfremmende bakterier. Vi etablerte en enkel metode for raskt å identifisere kjemoattractants som kunne indusere den kjemoaktiske bevegelsen av rhizosphere vekstfremmende bakterier på sterile glasssklier via enkle trinn. Bakterieoppløsning (OD600 = 0,5) og steril kjemoattractant vandig oppløsning ble tilsatt dråpevis på glasssklie med et intervall på 1 cm. En inokulerende sløyfe ble brukt til å koble den kjemoattractant vandige løsningen til bakterieløsningen. Skredet ble holdt ved romtemperatur i 20 minutter på den rene benken. Til slutt ble den kjemoattractant vandige løsningen samlet inn for bakteriell telling og mikroskopisk observasjon. I denne studien, gjennom flere sammenligninger av eksperimentelle resultater, overvant metoden flere mangler ved tradisjonelle bakterielle chemotaxis-metoder. Metoden reduserte feilen ved platetelling og forkortet den eksperimentelle syklusen. For identifisering av kjemoattractant stoffer kan denne nye metoden spare 2-3 dager sammenlignet med den tradisjonelle metoden. I tillegg tillater denne metoden enhver forsker systematisk å fullføre et bakterielt chemotaxis-eksperiment innen 1-2 dager. Protokollen kan betraktes som en verdifull ressurs for å forstå plantemikrobeinteraksjoner.
Introduction
Chemotaxis er viktig for kolonisering av plantevekstfremmende rhizobakterielle (PGPR) på røtter og for å forstå plantemikrobeinteraksjoner1. En klasse av lavmolekylære forbindelser (kjemoattractants) i planterot eksudater induserer den kjemoaktiske bevegelsen av PGPR til rhizosfæren2. Malinsyre, sitronsyre og andre komponenter i roten eksudater stimulerer chemotaxis av Bacillus stammer3. For eksempel rekrutterer glukose, sitronsyre og fumarsyre i maisrot bakterier til rotoverflaten4. D-galaktose, som er avledet fra rot eksudater, induserer chemotaxis av Bacillus velezensis SQR95. Organiske syrer, inkludert fumarat, malinsyre og succinat, påvirker chemotaxis og kolonisering av ulike PGPR i Cajanus cajan – Zea mays intercropping system6. Oleanolic syre i risrot eksudaterer, fungerer som et kjemoattractant for stammen FP357. Andre planteeksudater (inkludert histidin, arginin og aspartat) kan spille en avgjørende rolle i den kjemosaktiske responsen til bakterier8. Plante eksudater fungerer som et signal for å lede bevegelsen av bakterier, som er det første trinnet under rhizosphere kolonisering. Plantekolonisering av PGPR er en prosess med enorm relevans, da PGPR er gunstig for planteverten.
Mange metoder har blitt brukt til å analysere bakteriell chemotaxis. Svømmeplatemetoden er en av metodene som er beskrevet tidligere9. I denne metoden ble plater laget med et semisolid medium. En kjemoaktisk buffer som inneholder agar (1,0 %, m/v) ble lagt til platen. Bufferen oppvarmes, og blandes deretter med kjemoattractanten. Deretter ble 8 μL bakterieoppheng tilsatt dråpevis til midten av platen og platen ble plassert i en inkubator ved 28 °C. Platen ble regelmessig observert og fotografert. Imidlertid var den eksperimentelle syklusen til svømmeplatemetoden veldig lang. I den kapillærlignende metoden10 fungerer en pipettespiss som et kammer for å holde 100 μL bakteriell suspensjon. 1 ml sprøytenål ble brukt som kapillær. En sprøytenål som inneholder kjemoattractants med forskjellige konsentrasjonsgradienter ble satt inn i 100 μL pipettespissen. Etter inkubasjon ved romtemperatur i 3 timer ble sprøytenålen fjernet, innholdet ble fortynnet og belagt på mediet. Bakterieakkumuleringen i sprøyten var representert av kolonidannende enheter (CFUer) i platene. Den eksperimentelle feilen innen replikeringer for den kapillærlignende metoden var imidlertid stor. En annen metode brukte en mikrofluidisk SlipChip-enhet11. Kort sagt ble bovint serumalbumin (BSA) løsning injisert i alle kanaler og fjernet ved hjelp av et vakuum. Løsningene som inneholder forskjellige kjemoattractants (1 mM konsentrasjon kun for kvalitativ deteksjon), bakterieceller suspendert i fosfatbufret saltvann og fosfatbufret saltvannsbuffer (negativ kontroll) ble tilsatt til henholdsvis topp-, midt- og bunnmikrowells. Inkubasjon ble deretter utført i et mørkt miljø ved romtemperatur i 30 minutter. Bakteriecellene ble deretter oppdaget i mikrowells. Den mikrofluidiske SlipChip-enheten var imidlertid dyr. Derfor hadde hver av metodene beskrevet ovenfor fordeler og ulemper.
Vi etablerte en forbedret chemotaxis-analyse for rask identifisering av rhizobakterielle kjemoattractanter i roteksudater ved hjelp av sterile glasssklier uten kompliserte trinn. I denne studien, gjennom flere sammenligninger av eksperimentelle resultater, overvant metoden flere mangler ved tradisjonelle bakterielle chemotaxis-metoder. Metoden reduserte feilen ved platetelling og forkortet den eksperimentelle syklusen. Derfor, hvis den brukes til å identifisere et kjemoattractant stoff, kan denne nye metoden spare 2-3 dager og redusere kostnadene for eksperimentelle materialer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Økende forskning tyder på at plantebakterieinteraksjoner hovedsakelig forekommer i rhizosfæren og påvirkes av roteksudater20,21,22,23,24. Planteroteksudater inkluderer et mangfoldig utvalg av primære metabolitter, inkludert fenolsyrer, organiske syrer og aminosyrer samt mer komplekse sekundære forbindelser25,26,27.<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Nos. 31870493), Key Research and Development Projects i Heilongjiang, Kina (GA21B007), og de grunnleggende forskningsavgiftene for universiteter i Heilongjiang-provinsen, Kina (nr. 135409103).
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
References
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).
- Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. Root exudates mediated interactions belowground. Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).
- Zhang, N., et al. Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains. Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).
- Zhang, N., et al. Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates. BMC Genomics. 16 (1), 685 (2015).
- Lui, Y., et al. Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).
- Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan – Zea mays intercropping system. Rhizosphere. 18 (12), 100331 (2021).
- Sampedro, I., et al. Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T. Microorganisms. 8 (4), 575 (2020).
- Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).
- Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere. European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Shen, C., et al. Bacterial chemotaxis on Slipchip. Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).
- Liu, H., et al. Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).
- Goswami, M., Deka, S. Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens. Microbiological Research. 240, 126516 (2020).
- Kaiira, M., Chemining’Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize. Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).
- Shi, Y., et al. Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans. African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).
- Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice. Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).
- Belimov, A. A., et al. Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum). Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).
- Ankati, S., Podile, A. R. Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner. Journal of Plant Physiology. 243, 153057 (2019).
- Gordillo, F., Chavez, F., Jerez, C. A. Motility and chemotaxis of Pseudomonas sp. B4 towards polychlorobiphenyls and chlorobenzoates. FEMS Microbiology Ecology. 60 (2), 322-328 (2007).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions. Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).
- Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).
- Kamilova, F., et al. Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum. Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).
- Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates. Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).
