En förbättrad Chemotaxis-analys för snabb identifiering av Rhizobacterial Chemoattractants i Root Exudates
Summary
Här presenterar vi ett förbättrat chemotaxis analysprotokoll. Målet med detta protokoll är att minska stegen och kostnaderna för traditionella bakteriella chemotaxis-metoder och att fungera som en värdefull resurs för att förstå växtmikroberinteraktioner.
Abstract
Chemotaxis identifiering är mycket viktigt för forskning och tillämpning av rhizosfär tillväxtfrämjande bakterier. Vi etablerade en enkel metod för att snabbt identifiera de kemoattractanter som kan inducera den chemotactic rörelsen av rhizosphere tillväxtfrämjande bakterier på sterila glasrutschbanor via enkla steg. Bakterielösning (OD600 = 0,5) och steril chemoattractant vattenlösning tillsattes dropwise på glasrutschbanan med ett intervall av 1 cm. En inokurerande slinga användes för att ansluta chemoattractant vattenlösning till bakterielösningen. Rutschkanan hölls i rumstemperatur i 20 minuter på den rena bänken. Slutligen samlades chemoattractant vattenlösning för bakteriell räkning och mikroskopisk observation. I denna studie, genom flera jämförelser av experimentella resultat, metoden övervann flera brister i traditionella bakteriella chemotaxis metoder. Metoden minskade felet vid platträkning och förkortade försökscykeln. För identifiering av kemoattractantämnen kan denna nya metod spara 2-3 dagar jämfört med den traditionella metoden. Dessutom tillåter denna metod alla forskare att systematiskt slutföra ett bakteriellt chemotaxis-experiment inom 1-2 dagar. Protokollet kan betraktas som en värdefull resurs för att förstå interaktioner mellan växter och mikrober.
Introduction
Chemotaxis är viktigt för kolonisering av växttillväxtfrämjande rhizobacterial (PGPR) på rötter och för att förstå växt-mikrob interaktioner1. En klass av låg molekylvikt föreningar (chemoattractants) i växt rot exudates inducera chemotactic rörelse av PGPR till rhizosphere2. Äppelsyra, citronsyra och andra komponenter i rotexudaterna stimulerar chemotaxis av Bacillus stammar3. Till exempel rekryterar glukos, citronsyra och fumarsyra i majsrot bakterier till rotytan4. D-galaktos, som härrör från rotexudater, inducerar chemotaxis av Bacillus velezensis SQR95. Organiska syror, inklusive fumarat, äppelsyra och succinate, påverkar chemotaxis och kolonisering av olika PGPR i Cajanus cajan – Zea mays intercropping system6. Oleanolic syra i ris rot exudates, fungerar som en chemoattractant för stammen FP357. Andra växtexudater (inklusive histidin, arginin och aspartat) kan spela en avgörande roll i den chemotactic svaret av bakterier8. Växtexudater fungerar som en signal för att styra bakteriens rörelse, vilket är det första steget under rhizosfärkolonisering. Växtkolonisering av PGPR är en process av enorm relevans, eftersom PGPR är till nytta för växtvärden.
Många metoder har använts för att analysera bakteriell chemotaxis. Simplattans metod är en av de metoder som beskrivits tidigare9. I denna metod gjordes plattor med ett semisolid medium. En chemotactic buffert som innehåller agar (1,0%, w/v) lades till på plattan. Bufferten värms upp och blandas sedan med chemoattractanten. Sedan tillsattes 8 μL bakterie suspension dropwise till mitten av plattan och plattan placerades i en inkubator vid 28 °C. Plattan observerades och fotograferades regelbundet. Försökscykeln för simplattans metod var dock mycket lång. I den kapillärliknande metoden10 fungerar en pipettspets som en kammare för att hålla 100 μL bakteriefjädring. 1 ml sprutnål användes som kapillär. En sprutnål som innehåller chemoattractants med olika koncentrationsgradienter sattes in i 100 μL pipettspetsen. Efter inkubation vid rumstemperatur i 3 h avlägsnades sprutnålen, innehållet späddes ut och pläterades på mediet. Bakteriell ackumulering i sprutan representerades av kolonibildande enheter (CFUs) i plattorna. Det experimentella felet inom replikerar för kapillärliknande metoden var dock stort. En annan metod använde en mikrofluidisk SlipChip-enhet11. Kort, nötkreatur serum albumin (BSA) lösning injicerades i alla kanaler och togs bort med hjälp av ett vakuum. Lösningarna som innehåller olika chemoattractanter (1 mM koncentration endast för kvalitativ detektion), bakterieceller suspenderade i fosfatbuffrade saltlösning och fosfat buffrade saltlösning buffert (negativ kontroll) lades till topp, mitten och botten mikrowells, respektive. Inkubation utfördes sedan i en mörk miljö vid rumstemperatur i 30 minuter. Bakteriecellerna upptäcktes sedan i mikrobrunnarna. Den mikrofluidiska SlipChip-enheten var dock dyr. Därför hade var och en av de metoder som beskrivs ovan fördelar och nackdelar.
Vi etablerade en förbättrad chemotaxis analys för snabb identifiering av rhizobacterial chemoattractants i rot exudat med sterila glas glider utan komplicerade steg. I denna studie, genom flera jämförelser av experimentella resultat, metoden övervann flera brister i traditionella bakteriella chemotaxis metoder. Metoden minskade felet vid platträkning och förkortade försökscykeln. Därför, om den används för att identifiera ett kemoattractantämne, kan denna nya metod spara 2-3 dagar och minska kostnaden för experimentella material.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ökande forskning visar att interaktioner mellan växter och bakterier främst förekommer i rhizosfären och påverkas av rotexudater20,21,22,23,24. Växtrotexudater inkluderar en mängd olika primära metaboliter, inklusive fenolsyror, organiska syror och aminosyror samt mer komplexa sekundära föreningar25,26,27<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 31870493), de viktigaste forsknings- och utvecklingsprojekten i Heilongjiang, Kina (GA21B007) och de grundläggande forskningsavgifter för universitet i Heilongjiang-provinsen, Kina (nr 135409103).
Materials
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 490-79-9 | |
| Acetonitrile | CNW Technologies | 75-05-8 | |
| Ammonium acetate | CNW Technologies | 631-61-8 | |
| Caffeic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 331-39-5 | |
| Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Fresco17 | |
| Citric acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 77-92-9 | |
| Clean bench | Shanghai Boxun Industrial Co., Ltd. | BJ-CD | |
| Ferulic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 1135-24-6 | |
| Formic acid | CNW Technologies | 64-18-6 | |
| Fructose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 57-48-7 | |
| Galactose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 59-23-4 | |
| Glycine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-40-6 | |
| Grinding Mill | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. |
JXFSTPRP-24 | |
| Histidine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 71-00-1 | |
| Internal standard: 2-Chloro-L-phenylalanine | Shanghai Hengbai Biotech C.,Ltd. | 103616-89-3 | |
| Leucine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 61-90-5 | |
| Malic acid | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 6915-15-7 | |
| Mannose | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 3458-28-4 | |
| Mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific | Q Exactive Focus | |
| Methanol | CNW Technologies | 67-56-1 | |
| Optical Microscope | Olympus | BX43 | |
| Phenylalanine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 63-91-2 | |
| Proline | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 147-85-3 | |
| Scales | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Serine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 56-45-1 | |
| Threonine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 72-19-5 | |
| UHPLC | Agilent | 1290 UHPLC | |
| Ultrasound Instrument | Shenzhen Leidebang Electronics Co., Ltd. |
PS-60AL | |
| Valine | Beijing InnoChem Science & Technology C.,Ltd. | 7004-03-7 |
References
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends in Microbiology. 22 (9), 517-527 (2014).
- Haichar, Z., Santaella, C., Heulin, T., Achouak, W. Root exudates mediated interactions belowground. Soil Biology and Biochemistry. 77 (7), 69-80 (2014).
- Zhang, N., et al. Effects of different plant root exudates and their organic acid components on chemotaxis, biofilm formation and colonization by beneficial rhizosphere-associated bacterial strains. Plant and Soil. 374 (1-2), 689-700 (2014).
- Zhang, N., et al. Whole transcriptomic analysis of the plant-beneficial rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens SQR9 during enhanced biofilm formation regulated by maize root exudates. BMC Genomics. 16 (1), 685 (2015).
- Lui, Y., et al. Induced root-secreted D-galactose functions as a chemoattractant and enhances the biofilm formation of Bacillus velezensis SQR9 in an mcpa-dependent manner. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (17), 785-797 (2020).
- Vora, S. M., Joshi, P., Belwalkar, M., Archana, G. Root exudates influence chemotaxis and colonization of diverse plant growth-promoting rhizobacteria in the Cajanus cajan – Zea mays intercropping system. Rhizosphere. 18 (12), 100331 (2021).
- Sampedro, I., et al. Effects of halophyte root exudates and their components on chemotaxis, biofilm formation and colonization of the halophilic bacterium halomonas anticariensis FP35T. Microorganisms. 8 (4), 575 (2020).
- Liu, X. L., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. A dual role amino acid from sesbania rostrata seed exudates in the chemotaxis response of Azorhizobium caulinodans ORS571. Molecular Plant-Microbe Interactions. 32 (9), 1134-1147 (2019).
- Ling, N., Raza, W., Ma, J. H., Huang, Q. W., Shen, Q. R. Identification and role of organic acids in watermelon root exudates for recruiting Paenibacillus polymyxa SQR-21 in the rhizosphere. European Journal of Soil Biology. 47 (6), 374-379 (2011).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiology. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Shen, C., et al. Bacterial chemotaxis on Slipchip. Lab on a Chip. 14 (16), 3074-3080 (2014).
- Liu, H., et al. Bacillus pumilus LZP02 promotes rice root growth by improving carbohydrate metabolism and phenylpropanoid biosynthesis. Molecular Plant-Microbe Interactions. 33 (10), 1222-1231 (2020).
- Goswami, M., Deka, S. Isolation of a novel rhizobacteria having multiple plant growth promoting traits and antifungal activity against certain phytopathogens. Microbiological Research. 240, 126516 (2020).
- Kaiira, M., Chemining’Wa, G., Ayuke, F., Baguma, Y., Nganga, F. Profiles of compounds in root exudates of rice, cymbopogon, desmodium, mucuna and maize. Journal of Agricultural Sciences Belgrade. 64 (4), 399-412 (2019).
- Shi, Y., et al. Effect of rice root exudates and strain combination on biofilm formation of Paenibacillus polymyxa and Paenibacillus macerans. African Journal of Microbiology Research. 6 (13), 3343-3347 (2012).
- Lee, H. W., Ghimire, S. R., Shin, D. H., Lee, I. J., Kim, K. U. Allelopathic effect of the root exudates of K21, a potent allelopathic rice. Weed Biology and Management. 8 (2), 85-90 (2008).
- Belimov, A. A., et al. Rhizobacteria that produce auxins and contain 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid deaminase decrease amino acid concentrations in the rhizosphere and improve growth and yield of well-watered and water-limited potato (Solanum tuberosum). Annals of Applied Biology. 167 (1), 11-25 (2015).
- Ankati, S., Podile, A. R. Metabolites in the root exudates of groundnut change during interaction with plant growth promoting rhizobacteria in a strain-specific manner. Journal of Plant Physiology. 243, 153057 (2019).
- Gordillo, F., Chavez, F., Jerez, C. A. Motility and chemotaxis of Pseudomonas sp. B4 towards polychlorobiphenyls and chlorobenzoates. FEMS Microbiology Ecology. 60 (2), 322-328 (2007).
- Bais, H. P., Weir, T. L., Perry, L. G., Gilroy, S., Vivanco, J. M. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms. Annual Review of Plant Biology. 57, 233-266 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Badri, D. V., Weir, T. L., Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: plant-microbe interactions. Curr Opin Biotech. Current Opinion in Biotechnology. 20 (6), 642-650 (2009).
- Kamilova, F., Kravchenko, L. V., Shaposhnikov, A. I., Makarova, N., Lugtenberg, B. Effects of the tomato pathogen Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici and of the biocontrol bacterium Pseudomonas fluorescens WCS365. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (10), 1121-1126 (2006).
- Kamilova, F., et al. Organic acids, sugars, and L-tryptophane in exudates of vegetables growing on stonewool and their effects on activities of rhizosphere bacteria. Molecular Plant-Microbe Interactions. 19 (3), 250-256 (2006).
- Badri, D. V., Vivanco, J. M. Regulation and function of root exudates. Plant Cell Environment. 32 (6), 666-681 (2009).
- Hao, W. Y., Ren, L. X., Ran, W., Shen, Q. R. Allelopathic effects of root exudates from watermelon and rice plants on Fusarium oxysporum f.sp. Niveum. Plant and Soil. 336 (1-2), 485-497 (2010).
- Hao, Z. P., Wang, Q., Christie, P., Li, X. L. Allelopathic potential of watermelon tissues and root exudates. Scientia Horticulturae. 112 (3), 315-320 (2007).
